Microbial diversity: from vine to wine

[Traducción libre al español de la intervención de la ponente en inglés.]

El propósito de la charla será dar una visión general sobre la microbiota, de la vid al vino, y lo que sabemos en este momento sobre su diversidad genética. Y saber que los microorganismos juegan un papel clave durante el proceso de elaboración del vino. En la superficie de la uva tenemos tres familias principales diferentes de microbiota, a saber, levaduras, bacterias y hongos, a menudo, por supuesto, siempre asociados con el nivel de la calidad del cultivo. En cuanto a la fermentación pasamos a otro sistema donde, por supuesto, será especialmente dominante Saccharomyces cerevisiae con un nivel de población muy alto que oscila entre 10 y 100 millones de células por mililitro. Luego tenemos también una parte de levaduras no Saccharomyces que tienen un nivel de población más bajo y también bacterias lácticas y acéticas. Veremos también que al principio, durante la fermentación alcohólica, la población de bacterias es bastante baja debido al desarrollo y el crecimiento de las levaduras. A continuación, en el proceso de enriquecimiento del vino puede producirse la fermentación maloláctica, frecuentemente realizada en la vinificación del vino tinto donde las bacterias lácticas juegan un papel clave, especialmente una especie, Oenococcus oeni, que puede alcanzar un alto nivel de población, de 1 a 10 millones de células por mililitro. A menudo, durante el proceso de envejecimiento del vino hay microorganismos que pueden deteriorarlo como es el caso de una especie de levadura: Brettanomyces bruxellensis. Comentaremos brevemente sobre esta especie más adelante. Y finalmente, por supuesto, también podemos tener bacterias acéticas en el vino.

Partiré del hecho de que esta microbiota puede tener variaciones temporales y espaciales muy importantes. Podemos comenzar por el período invernal, en el suelo, donde su comportamiento deja una huella específica (creo que habrá una conferencia sobre eso más adelante). La microbiota juega un papel importante en los ciclos biogeoquímicos del suelo. La fertilidad, la química y la microbiota intervienen en la fijación de nitrógeno, fosfato, solubilización de hierro, enzimas responsables de involucrar el crecimiento de las plantas y, por supuesto, en el ciclo del carbono. En el viñedo, en la interfaz entre la planta y el suelo hay un compartimento muy importante que es la rizosfera. En la rizosfera es donde hay una fuerte interacción entre la microbiota y la vid y las raíces, y hay algunos fenómenos de migración de la rizosfera a los órganos de la superficie. Recientemente, algunos trabajos han encontrado evidencia de que ciertos microorganismos fermentadores como bacterias y también levaduras podrían convertirse en endofitos de las uvas a través de las raíces del xilema y así ser parte de la comunidad microbiana en la superficie de las uvas maduras. También hay alguna evidencia de que el suelo del período invernal es una especie de reservorio principal para levaduras y bacterias, ya que podrían sobrevivir en el suelo durante el período invernal y luego se diseminarán a los órganos de la superficie durante el crecimiento vegetativo de la vid. Otro compartimento muy importante para la microbiota es la filosfera. La microbiota atmosférica es otro contribuyente a las comunidades de los órganos de superficie a saber, flores, frutos y hojas. Esta microbiota ambiental se disemina en los viñedos a través de diferentes vectores, entre los que podemos considerar el viento, pero también artrópodos como abejas, avispas, moscas de la fruta, así como aves que pueden ser vectores de levaduras y bacterias en el viñedo. Estos son vectores que juegan un papel importante en la colonización de, por ejemplo, las hojas y la superficie de las bayas de uva en la etapa de maduración. Los insectos representan un vínculo entre el área cercana a los viñedos como, por ejemplo, los árboles del bosque y podrían ser vectores de la microbiota del entorno. Por lo general, consideramos que los artrópodos y los insectos pueden diseminar la microbiota a una distancia corta de unos pocos metros a un kilómetro. Es un ejemplo de diseminación local, mientras que las aves pueden diseminar las levaduras a una distancia mucho mayor, desde algunos kilómetros hasta 100 kilómetros como se demostró, por ejemplo, en Nueva Zelanda. Este aspecto de la diseminación de la microbiota a través de diferentes vectores es muy importante para entender el sistema global. Al respecto, hay una teoría propuesta por investigadores de la ciencia de las plantas que introducen el concepto de holobionte: el conjunto de una planta con su comunidad microbiana asociada considerado como una sola entidad. La idea detrás de este concepto es el hecho de que la microbiota, que proporciona un nuevo fenotipo, lo consideramos un fenotipo extendido. De esta forma, la comunidad microbiana proporcionará nuevas propiedades, nuevos rasgos que podrían desempeñar un papel relevante, por ejemplo, en el crecimiento de las plantas o en su salud y en el manejo del estrés biótico o abiótico.

Desde la perspectiva de la evolución, la historia de la evolución de la vid, podemos considerar que es una unidad de selección donde las interacciones de la planta y el microbioma han coevolucionado para mantener la funcionalidad y la aptitud del huésped durante estas escalas de tiempo evolutivas. Por lo tanto, debemos abarcar no solo la vid y las bayas de uva, sino también su microbiota asociada, que es un sistema que trabaja en conjunto y evoluciona también en conjunto. Hemos visto la variación de la evolución temporal de la microbiota desde el invierno, por ejemplo, durante el crecimiento vegetativo. Disponemos también de la primera evidencia de lo que llamamos biogeografía microbiana, un término proporcionado por el equipo de investigación de Nicolas Bokulich, de la Universidad de Davis, en 2014. Este equipo recolectó alrededor de 270 muestras en los viñedos de California y utilizando tecnologías de secuenciación de próxima generación basadas en la secuenciación del ADN de la comunidad microbiana permitieron profundizar en la estructura de la biodiversidad de las comunidades microbianas y mostrar por primera vez que la biogeografía microbiana de la uva está asociada no aleatoriamente con factores regionales, varietales y climáticos en zonas vitivinícolas multiescala. En la diapositiva está el título de su publicación. Es decir, si consideramos una zona de producción de vino diferente, por ejemplo, en California, encontraremos una diferencia significativa en términos de diversidad microbiana y también de estructura microbiana, mostrando que hay un impacto en la variedad y también un impacto de los factores del clima. El equipo de Davis pudo demostrar que de una añada a otra había una diferencia significativa en la comunidad microbiana presente en las muestras de uva. A partir de este primer trabajo de investigación, se han realizado muchos estudios en todo el mundo que confirman la existencia de la biogeografía microbiana, estudios a diferentes escalas: globales, regionales y locales teniendo en cuenta diferentes compartimentos, por ejemplo, en América del Sur, Argentina, Chile, raíces, bayas de uva, hojas y también inicialmente la piel de la uva en Grecia, mosto en China y también en Nueva Zelanda. Estudios científicos que concluyeron que en la biogeografía microbiana considerada a diferentes escalas: regional, local, presenta diferencias significativas en cuanto a la comunidad microbiana del viñedo. También puede realizarse el estudio de la microbiota a nivel de comunidad, por lo que, considerando un conjunto completo de diferentes microorganismos, podemos estudiar la biogeografía microbiana a nivel de población considerando solo una especie clave. Por supuesto, se ha hecho para Saccharomyces cerevisiae, especie de gran importancia en el proceso de elaboración del vino. Se han realizado muchos trabajos de investigación sobre la diversidad genética de Saccharomyces cerevisiae en el viñedo, pero también durante la fermentación alcohólica espontánea del mosto y, hasta ahora, los trabajos de investigación han podido demostrar que existe una diferenciación poblacional de Saccharomyces cerevisiae a escala global y regional, pero no a escala local, a escala de viñedo. Probablemente se deba a aspectos de la diseminación ya mencionados, al hecho de que en los viñedos no hay barreras físicas, y la levadura y las bacterias pueden ser diseminadas a poca distancia por insectos, artrópodos, viento y pájaros, por lo que escala local o de viñedo no existe una diferenciación significativa relacionada con Saccharomyces cerevisiae. Otro aspecto muy importante para el sector productor del vino es el terroir, que plantea dudas si se considera terroir la presencia de una cepa de levadura nativa en un viñedo determinado que solo está presente en esa área. Es una especie de historia de que alguna cepa específica será única para este viñedo, para esta bodega. Pero hasta ahora no hay pruebas científicas sólidas de ello. La siguiente diapositiva recoge algunos resultados al respecto. Pudimos estudiar la diversidad de Saccharomyces cerevisiae recolectados de la fermentación espontánea en una misma bodega durante un largo plazo. El primer muestreo fue en 1992, 1993 y continuamos con diferentes cosechas, aún seguimos estudiando la diversidad genética de la población de Saccharomyces cerevisiae.

Como puede verse en el gráfico, cada color es representativo de una cosecha, por lo que se aprecia una diferenciación específica de la población de Saccharomyces cerevisiae según la cosecha. En azul, cepas recolectadas en 2014; en rosa, cepas recolectadas en 2016, muy diferente, y en verde, cepas recolectadas en 2017. Estos resultados en un viñedo y bodega específicos en el área de Burdeos muestran que no hay estabilidad interna de la población de Saccharomyces cerevisiae en una bodega determinada. De hecho, el tiempo es el factor que da forma, que dará forma a la población de Saccharomyces cerevisiae. Al contrario que en otros trabajos de investigación que muestran que de una cosecha a otra podría haber la misma población de Saccharomyces cerevisiae, cuando se realiza el estudio a largo plazo, no se obtiene el mismo resultado, por lo que realizar estudios a largo plazo podría ser muy importante para la visión global la estabilidad genética interna de la población de Saccharomyces cerevisiae en una bodega determinada. Entonces, ¿qué pasa con otra especie fermentativa importante como Oenococcus oeni? Aquí les muestro algunos datos muy buenos obtenidos por mi colega Patrick Lucas del ISVV. Patrick es un estudiante de doctorado que recolectó diferentes cepas de Oenococcus oeni de diferentes viñedos. En Burdeos, Borgoña, sur de Francia y en el Líbano.  También en diferentes productos fermentados como la sidra y la kombucha. Como puede verse en el gráfico, se establece lo que llamamos árbol filogenético, un tipo de representación que destaca las relaciones de vínculos, la relación genética entre las diferentes cepas. La idea a retener con este trabajo es que el substrato, no la región, es quien explica la estructura poblacional de Oenococcus oeni. Para esta especie, por tanto, no hay evidencia de existencia biogeográfica. Está más relacionado con el origen del sustrato del que se recolectó la cepa probablemente en relación con algunas propiedades específicas de adaptación de la cepa a la sidra que no son las mismas que las propiedades específicas de adaptación al vino y a la kombucha, por ejemplo.

Si pasamos de la microbiota del viñedo al vino, especialmente en una etapa de madurez, la baya representa una fuente principal de microorganismos fermentativos. Cuando movemos la uva, trituramos las bayas, obtenemos el mosto, produciremos una fuerte disminución de la diversidad microbiana debido al hecho de que pasamos de un medio muy pobre en contacto con el oxígeno, que es la superficie de una baya de uva, a otro estresante que es nuestro medio ambiente, el mosto, donde hay una gran cantidad de azúcar, baja acidez, bajo pH, y también dióxido de azufre agregado para proteger el mosto de la oxidación. Debido a esta fuerte modificación del medio hay una fuerte disminución de la diversidad microbiana y solo algunas especies específicas de levadura, de bacterias lácticas, podrán sobrevivir e iniciar un crecimiento. No lo mencioné antes, pero es algo muy importante para entender el proceso: Saccharomyces cerevisiae y Oenococcus oeni son bastante raros en el viñedo. Si se pretende recolectar Saccharomyces en el viñedo, por ejemplo, en la superficie de la uva, deben utilizarse procedimientos de enriquecimiento para asegurarse el poder aislar algunas colonias. Ambas especies fermentativas son bastante raras en el viñedo ya que no están bien adaptadas al medio ambiente, su nicho específico es realmente el proceso fermentativo y las bebidas fermentadas.

Teniendo en cuenta la fuerte modificación del medio, debemos considerar que la microbiota del viñedo es bastante diferente de la microbiota de fermentación debido a esta selección y disminución de la diversidad. Disponemos de evidencia de que las uvas son la primera fuente de microorganismos fermentadores, incluido Saccharomyces cerevisiae, por lo que en este trabajo de investigación nos propusimos cuantificar el flujo de esta especie entre las uvas y el mosto, inferimos el intercambio genético entre las bayas de uva de viñedo y el mosto y mostramos que hay un fuerte flujo de cepa, concretamente 195, que es el número de migrantes por generación de levadura de la uva a las bodegas, con un flujo de retorno que es menor, de 55 migrantes por generación, así que es una especie de continuidad de las uvas al vino, por lo que las uvas inocularán el mosto, y el mosto y las bodegas inocularán el viñedo, una inoculación que se producirá a través de un sistema de aireación para evacuar el CO₂, por ejemplo. Otro vector puede ser, Drosophila, por ejemplo, cuando recolecta en el orujo del exterior de la bodega, si está cerca del viñedo, que podrá tener algunas manchas de microbiota de orujo. De esta forma, la especie cierra el círculo del sistema. Al ser realmente la principal especie del vino, dominará el sistema y construirá su propio nicho al producir etanol y aumentar la temperatura, variables que proporcionan a Saccharomyces cerevisiae alguna ventaja de aptitud sobre otros miembros de la comunidad microbiana. Algo que ocurrirá en cualquier parte del mundo donde se esté elaborando vino. Si representamos la dinámica de la población de levadura durante la fermentación alcohólica, en este caso durante la fermentación espontánea de mosto de uva blanca chardonnay de Nueva Zelanda, observamos en el gráfico que antes del inicio de la fermentación alcohólica hay algunas especies dominantes no Saccharomyces, especialmente H. uvarum, que ahora se llama Starmerella bacillaris y algunas especies menores no Saccharomyces (I. orientalis, M. pulcherrima y T. delbruekii). En ese estadio el nivel de población de Saccharomyces cerevisiae es bastante bajo, comenzando con 1000 células por mililitro para alcanzar 100 millones de células por mililitro en unos pocos días. Entonces, tan pronto como S. cerevisiae es dominante en el sistema, habrá una disminución de las levaduras no Saccharomyces e incluso no podremos detectarlas considerando nuestra metodología de análisis. Se trata de una dinámica bastante común en la fermentación espontánea en todo el mundo. Una cuestión a investigar podría ser cuál es la diversidad de cepas de S. cerevisiae que conducen la fermentación alcohólica, en el mosto y en el mosto en fermentación y fermentado. Los análisis realizados mediante el uso de herramientas moleculares de PCR para obtener huellas genéticas sobre muestras obtenidas de una fermentación espontánea en Nueva Zelanda evidencian una gran diversidad de S. cerevisiae, aunque a veces aparece una cepa dominante espontánea. Por tanto, en una fermentación espontánea podemos tener una de las dos opciones: alta diversidad genética o baja diversidad genética de S. cerevisiae. Cuando inoculamos el mosto tendemos, por supuesto, la segunda opción, con el dominio de una cepa de S. cerevisiae. Es decir, cuando agregamos ciertas levaduras para fomentar la fermentación alcohólica, estamos imitando lo que el sistema espontáneo natural puede ofrecernos.

Si consideramos ahora las bacterias lácticas, sabemos que partimos de un nivel de población muy bajo al comienzo del proceso y una disminución durante la fermentación alcohólica. Será al finalizar la fermentación alcohólica que Oenococcus oeni iniciará el crecimiento alcanzando un millón de células por mililitro, con lo que la fermentación maloláctica comenzará. También podemos preguntarnos cuál es la diversidad de cepas de Oenococcus oeni. Nuevamente, la diapositiva contiene algunos resultados de mi colega, quien demostró que, en términos generales, el número de cepas durante la fermentación maloláctica puede oscilar entre 1 y 11, y en alrededor del 40 por ciento de los casos tres o cuatro cepas tienden a ser cepas autóctonas espontáneas.

Consideremos ahora la diversidad de la levadura que deteriora el vino. Disponemos de algunas evidencias porque pudimos desarrollar herramientas genéticas para descifrar la diversidad genética a nivel de cepa de Brettanomyces bruxellensis, y encontramos los mismos clones, los mismos perfiles genéticos en diferentes bodegas de una determinada región productora de vino. Un punto también muy específico es el hecho de que podemos clonar algunos perfiles genéticos que podrían evidenciarse durante décadas a partir de vinos en la misma bodega. Pudimos recolectar cepas de Brettanomyces en añadas muy antiguas, por lo que podríamos considerar que el estudio abarca un período muy largo, identificándose el mismo perfil genético en añadas muy viejas, pero también en añadas más recientes de una determinada bodega.

Este resultado muestra la alta capacidad de esta especie para ser residentes en bodega, probablemente a través de diferentes habilidades como desarrollar biofilm en los equipos de la bodega. Actualmente existe una base de consenso en toda la comunidad científica del mundo de que las bodegas son la principal fuente de contaminación del mosto por Brettanomyces bruxellensis.

¿Los enólogos guiarán el proceso de elaboración del vino paso a paso? ¿Podrán usar dióxido de azufre, que tiene efectos antimicrobianos solo en la etapa de ascenso? Porque luego, después de la fermentación alcohólica y la fermentación maloláctica, pueden aparecer algunos problemas con el uso de dióxido de azufre. En su uso contra Brett tenemos evidencia de que algunas cepas han desarrollado tolerancia o resistencia a los sulfitos, y en ese caso no resulta útil aumentar la cantidad de sulfitos durante el proceso de bodega porque hay cepas que podrían sobrevivir e incluso crecer y producir fenoles volátiles considerando una alta cantidad de SO₂. Una forma alternativa que los enólogos pueden usar para monitorear la población microbiana es controlar la temperatura, que es un aspecto muy importante durante el proceso de fermentación y crianza. Otra forma de control es utilizar la fermentación espontánea o la inoculación. Cuando se usa levadura seca activa para inocular el mosto, habrá muchas pérdidas de Saccharomyces porque se impondrá en el mosto la cepa dominante mientras que, considerando la fermentación espontánea, como mencioné antes, puede haber una cepa espontánea dominante adaptándose al mosto, por ejemplo, o podemos tener una gran diversidad de cepas diferentes.

Por lo general, surge una pregunta en este punto: ¿cuál es el vínculo entre la diversidad de la levadura y la calidad y complejidad del vino?  A menudo, la literatura científica o algunos sitios web respecto de esta diversidad, argumentan que podría ser una cepa no Saccharomyces la que aumente la calidad del vino, e igualmente, la que aumentará la complejidad del vino. Debo decir que hasta ahora la literatura científica no proporciona evidencia de que exista un vínculo entre la diversidad de levaduras y la calidad y complejidad del vino. Se trata de dos conceptos diferentes y, además, la complejidad del vino no es fácil de definir porque no solo está relacionada con la presencia de muchos compuestos diferentes, sino porque ahora tenemos evidencia de que hay alguna interacción sensorial entre diferentes compuestos volátiles, e igualmente interacción entre diferentes levaduras no Saccharomyces y Saccharomyces, así que ¡cuidado con este concepto! Puede resultar fácil y hasta lógico pensar que esta diversidad está relacionada con la complejidad del vino, pero hasta ahora no tenemos una explicación clara. Algo que sí sabemos a partir de la observación empírica es que una alta diversidad genética de Saccharomyces cerevisiae durante la fermentación alcohólica, a veces puede conducir a fermentaciones lentas, probablemente debido a las interacciones entre todas las cepas que podrían desarrollarse durante la fermentación alcohólica para obtener nutrientes, lo que entorpece la colonización del medio y da como resultado fermentaciones lentas y estancadas. Llegados a este punto, un mensaje en forma de titular sería que dado que ahora sabemos que la microbiota juega un papel importante en las células vegetales y el crecimiento, podemos estudiar la planta con su microbiota asociada como un holobionte, un organismo unificado.

La microbiota está muy diseminada en el medio ambiente. También hemos visto que los viñedos y las bodegas son dos ecosistemas con características muy contrastadas y estacionales, sin duda, pero están estrechamente conectados y no solo el flujo del viñedo o las uvas inoculará el mosto en las bodegas, sino que también podría haber flujo de regreso. Algo de microbiota regresa de las bodegas a los viñedos. La microbiota del viñedo es diferente a la microbiota fermentativa y las especies fermentativas son muy raras en el viñedo porque no están bien adaptadas a ese medio, a ese ecosistema. Hay que tener cuidado con la relación entre la diversidad de levaduras y la complejidad del vino, ya que no disponemos de evidencias. Podemos tener una enorme complejidad en el vino con una cepa dominante de Saccharomyces cerevisiae porque se produzca una expresión cualitativa de bayas de uva muy agradable en el terroir. Tampoco disponemos de evidencia de biogeografía microbiana a nivel local, pero para especies fermentativas no es tan evidente y la existencia del terroir y bacterias sigue siendo un debate abierto.

Muchas gracias por su atención.

Volver a Congreso Internacional ACE de la Enología y el Cava 2022