Empleo de ácido fumárico y quitosano para inhibir la fermentación maloláctica


Antonio Morata, Mª Antonia Bañuelos, Iris Loira, Andrea Villegas, Carmen González y José Antonio Suárez Lepe
enotecUPM. Universidad Politécnica de Madrid, España

Introducción

La fermentación maloláctica (FML) se desarrolla inoculada o no de forma habitual en vinos tintos; sin embargo, es más infrecuente en vinos blancos y rosados. Aunque en ocasiones sucede, incluso de forma indeseada, restando acidez y por tanto frescor a los vinos. En la actualidad, y quizás debido a consecuencias del cambio climático como la elevación del pH en los vinos, aumenta la frecuencia de estas FML indeseadas. Se pueden desarrollar distintas estrategias para evitar la FML no deseada.1 Entre ellas su control mediante aditivos bactericidas o bacteriostáticos, o el uso de técnicas físicas no térmicas (tabla 1).

En este trabajo se van a evaluar las ventajas del empleo de dos aditivos altamente efectivos en la inhibición de la FML: el quitosano y el ácido fumárico. Del primero está permitido su uso en vinos como clarificante,2 aunque como efecto colateral tiene una alta capacidad para bloquear el desarrollo de la FML.3 El segundo aceptado como acidificante y saborizante en el Codex alimentarius FAO-WHO en alimentos,4 y su capacidad inhibitoria sobre la FML en vinos se conoce desde los años setenta del siglo pasado.5

Tabla 1 Técnicas para impedir la fermentación maloláctica en vinos
HHP: altas presiones hidrostáticas; PEF: campos eléctricos pulsados; UHPH: ultrahomogeneización a alta presión

 

El quitosano es un polisacárido (β-1, 4-D-glucosamina parcialmente desacetilada) con densidad de carga positiva e insoluble (fig. 1). Se produce por desacetilación de la quitina que se puede obtener del exoesqueleto de crustáceos o de origen fúngico.7

Figura 1 Estructura del quitosano, acetilado y desacetilado

 

Varias empresas producen quitosano de origen fúngico para ser utilizado como clarificante y antimicrobiano y es de uso ecológico.22 El quitosano es insoluble, se mezcla con agua o una fracción de vino, se homogeneiza con el total y luego se retira una vez realizada la clarificación coloidal; se recomiendan periodos de contacto de unos 10 días.22 En este proceso se retiran microorganismos entre los que pueden estar bacterias lácticas, acéticas y levaduras alterantes como Brettanomyces.

El ácido fumárico (ácido trans-butenodioico; CAS# 110-17-8; PM 116,07 g/mol) es un sólido blanco poco soluble en agua y fácilmente analizable por LC-DAD por su alta respuesta en el UV debido al doble enlace. Dosis de hasta 600 mg/L de ácido fumárico no se detectan sensorialmente en pruebas triangulares.13 En ensayos de preferencia se observa en los vinos tratados con ácido fumárico una mayor acidez, un ligero efecto en el cuerpo, y en tintos un color más intenso por la modificación del pH.13

El efecto de quitosano y ácido fumárico es complementario, ya que el ácido fumárico aporta persistencia y protección postratamiento en botella, mientras que el del quitosano termina una vez se retira el clarificante.

 

Metodología

Para los ensayos de inhibición se ha usado la cepa Uvaferm Alpha® (Lallemand Inc., Montreal, CA) de Oenococcus oeni. Esta cepa es tolerante a: pH > 3,2; etanol < 15,5 % v/v; total SO2 < 50 mg/L; temperatura > 14 °C. Tiene requerimientos nutricionales normales, buena implantación rápida cinética fermentativa y baja producción de acidez volátil y aminas biógenas.

Los inóculos se han preparado en medio MLO (Pronadisa, Madrid, España) suplementado con un 10 % de zumo de tomate a 30 °C. La población se ha estimado por DO a 600 nm y verificado por plaqueo en profundidad en medio MLO. La población inicial en el vino inoculado de 7-log UFC/mL en el ensayo de inhibición en el que se evaluaron de forma independiente el ácido fumárico y el quitosano, y de 8-log en el ensayo de inhibición en que ambos se usaron de forma conjunta.

«El ácido fumárico se ha añadido a distintas concentraciones a partir de una disolución de 10 g/L. El quitosano se ha añadido dispersado en vino.»

Ácido fumárico (99,0 %) (Panreac, Barcelona, España), y quitosano Bactiless™ (Lallemand Inc., Montreal). El ácido fumárico se ha añadido a distintas concentraciones a partir de una disolución de 10 g/L. El quitosano se ha añadido dispersado en vino.

La evolución del ácido málico se ha determinado por análisis enzimático. Se ha empleado un autoanalizador enzimático mod Y15 (Biosystems, Barcelona, España).

Las FML se han desarrollado en vino tinto de la de la variedad tempranillo (V. vinifera L). Sus parámetros analíticos son: etanol (%, v/v) 12, pH 3,8, azúcares residuales <2 g/L. Se ha tratado térmicamente 10 min a 110 °C. Se ha comprobado la ausencia de bacterias viables en 10 mL. Los ensayos de inhibición de la FML se han realizado en volúmenes de 60 mL. Se ha mantenido un control sin inocular que no ha desarrollado la FML.

 

Resultados y discusión

En el vino con población 7-log de Oenococcus oeni (Oo), la dosis de quitosano de 0,2 g/L es insuficiente para detener la FML; sin embargo 0,5 g/L bloquean completamente la degradación de málico (fig. 2A). La ausencia de FML se mantiene durante más de 40 días. Hay que considerar que la población que se inocula es la de una FML vigorosa en pleno desarrollo, no una población residual que pudiera existir en un vino. En cambio, cuando se añade ácido fumárico a dosis de 0,3 y 0,6 ambas inhiben (fig. 2B). Ya se ha observado el efecto inhibitorio de dosis de fumárico de 0,3 a 0,6 g/L.13 Aunque en algunos casos 0,3 puede ser insuficiente dependiendo de la dosis de inóculo, de la composición nutricional del mosto, pH y T.

Figura 2 Efecto del quitosano (Q; 0,2 y 0,5 g/L; A) y del ácido fumárico (F; 0,3 y 0,6 g/L; B) en la degradación de ácido málico durante la FML de un vino tinto inoculado con una población inicial 7-log UFC/mL

 

Para comprobar el efecto conjunto de ambos inhibidores se ha hecho un segundo experimento aplicando diversas dosis de quitosano y ácido fumárico. En este experimento la dosis inoculada inicial de Oo ha sido de 8-log UFC/mL. En las figuras 3A y B se verifica que a dosis de ácido fumárico de 0,15 g/L y de quitosano de 0,1 y 0,2 g/L, no existe inhibición de la FML y se completan entre 5 y 15 días, cuando se adicionan de forma individual y conjunta. Por tanto, estas dosis no tienen efecto inhibitorio en las condiciones y vino estudiados. Previamente se ha observado que una dosis de 0,15 g/L de ácido fumárico no tiene una concentración adecuada para detener la FML.13 Dependiendo de las condiciones retrasa, pero no produce una inhibición siquiera parcial de la FML.

Sin embargo, cuando se utilizan las mismas dosis de quitosano pero con 0,3 g/L de ácido fumárico, los tratamientos individuales no resultan inhibitorios (figs. 3C y D), aunque la dosis de 0,3 g/L ralentiza el desarrollo de la FML (figs. 3C y D). Sin embargo, ambos tratamientos conjuntos muestran un mayor efecto inhibitorio (fig. 3C) y el de 0,2 g/L de quitosano con 0,3 de fumárico detiene la FML después de 5 días (fig. 3D), mostrando un efecto sinérgico. Pese a la alta población inicial inoculada (8-log UFC/mL), la degradación de málico es solo ligeramente superior al 50% (fig. 3D).

Figura 3 Efecto conjunto del quitosano (Q; 0,1 y 0,2 g/L) y del ácido fumárico (F; 0,15 y 0,3 g/L) en la degradación de ácido málico durante la FML de un vino tinto inoculado con una población inicial 8-log UFC/mL

 

El empleo de dosis reducidas de ambos inhibidores permite retrasar y/o detener la FML al aplicar quitosano complementado con el ácido fumárico. Además, existe un efecto protector residual por el fumárico que permanece en disolución incluso post embotellado. La inhibición de la FML además incide en la reducción de metabolitos fermentativos bacterianos potencialmente tóxicos como las aminas biógenas y en la reducción de los niveles necesarios de SO2. Colateralmente, debido al efecto acidificante del ácido fumárico se aumentan los niveles de SO2 libre y molecular y se intensifica el color en vinos tintos por efecto hipercrómico.13,23 El efecto acidificante del ácido fumárico es 1,5 veces el del ácido cítrico24, y se consiguen reducciones de pH de 0,1-0,2 unidades dependiendo del efecto tampón del vino cuando se utilizan dosis de 300-600 mg/L.

La apolaridad del ácido fumárico, debido a su doble enlace, hace que se comporte como anfipático, y sea más eficiente atravesando estructuras lipídicas como la membrana celular bacteriana. Por esto es más fácil que concentraciones más altas permeen al interior celular y muestre una mayor actividad antimicrobiana que otros ácidos como el láctico. Por otra parte no es inhibitorio frente a levaduras probablemente por metabolizarse intracelularmente.

 

Consideraciones finales

Quitosano y ácido fumárico son dos aditivos inocuos, que permiten controlar el desarrollo de bacterias lácticas y estabilizar los vinos frente a la FML. Su uso simultáneo tiene efectos complementarios y ligeramente sinérgicos. Constituyen una alternativa interesante y más eficaz que la lisozima para evitar pérdidas de acidez y frescura en los vinos por desarrollo indeseado de la FML. El ácido fumárico además tiene un ligero efecto acidificante a las dosis que se recomiendan como inhibidor de la FML. Dosis de hasta 600 mg/L de ácido fumárico son difíciles de detectar sensorialmente.

 

Agradecimientos

Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades project: [RTI2018-096626-B-I00]; European Regional Development Fund (ERDF) [FEDER INTERCONECTA EXP-00111498/ITC-20181125]- Proyecto FRESHWINES.

 

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