Estrategias para el desarrollo de la fermentación maloláctica en vinos con pH extremos

Introducción

Por diversas causas entre las que destacan los efectos del cambio climático, en los últimos años la industria enológica ha sufrido una transformación importante, convirtiéndose en un sector de constantes cambios e innovaciones. Las dificultades para llevar a cabo la fermentación maloláctica (FML) por parte de las bacterias lácticas (BL) han promovido el estudio, desarrollo y mejora de diferentes tecnologías para llevar a cabo este proceso con éxito. El control eficiente de la FML requiere un amplio conocimiento de la respuesta de las BL a las actuales condiciones de estrés que se encuentran en el mosto y en el vino.¹

La capacidad de las BL para realizar la FML está influenciada por muchos factores entre los que se incluyen el pH, la temperatura, el contenido de inhibidores del crecimiento (etanol, SO₂, ácidos grasos de cadena media, etc.), la escasez de nutrientes, las cepas de levadura que realizan la fermentación alcohólica (FA) y las diferentes interacciones entre las especies que forman la microbiota autóctona.^2,4 La supervivencia de las bacterias malolácticas en el vino bajo tales condiciones de estrés requiere el mantenimiento de la funcionalidad de la membrana celular para poder controlar la permeabilidad iónica y regular el intercambio de solutos y nutrientes entre el interior celular y el medio externo.¹ Entre los factores de estrés mencionados, el etanol se considera el más decisivo porque daña la membrana celular afectando gravemente a su integridad y por tanto a la viabilidad bacteriana.⁵ Tras el etanol, el segundo factor de estrés más importante que afecta a las BL durante el proceso de vinificación es el pH.¹

El cambio climático modifica el desarrollo de la vid y los perfiles de maduración del fruto. El aumento de la temperatura ambiente afecta a la acidez total, el pH de los mostos y una alta concentración de azúcar de los mostos, lo que implica vinos de baja acidez, y valores de pH y etanol altos debido a la sobremaduración.^6,7 La mayoría de los vinos tienen un pH que oscila entre 3,2 y 3,8, pero puede llegarse fácilmente hoy en día a valores inferiores a 3,0 o superiores a 4,0.^8-11 Por debajo de 3,2, en vinos muy ácidos, la FML es particularmente difícil debido a dos factores principales: por un lado, el estrés que supone el propio valor de pH en sí mismo y las dificultades que implica para un mantenimiento adecuado del intracelular de las bacterias; por otro, porque supone un efecto sinérgico negativo con otros factores, especialmente el sulfuroso (mayor cantidad de SO₂ libre y molecular a pH bajos). Sin embargo, cuanto mayor es el pH, la realización de la FML es más fácil, pero el inconveniente radica en que mayor variedad de bacterias serán capaces de desarrollarse, ya que más favorables son las condiciones para el crecimiento bacteriano y la consiguiente posible alteración de los mostos y vinos.

«En la actualidad, los vinos con baja acidez total y elevado pH son cada vez más frecuentes debido al cambio climático.»

Aunque Oenococcus oeni se ha considerado la especie predominante durante la FML espontánea, no es la única. Los vinos con un pH próximo a 4,0 permiten el desarrollo de BL y bacterias y levaduras no deseadas, así como la formación de compuestos tóxicos como aminas biógenas.^2,12,13 En la actualidad, los vinos con baja acidez total y elevado pH son cada vez más frecuentes debido al cambio climático. En el otro extremo, el uso cada vez mayor de variedades de uva de bajo pH en la vinificación y el interés en la realización de la FML en vinos blancos y espumosos hace que encontremos vinos de pH bajo en los que es muy difícil llevar a cabo la FML. En ambos casos es necesario un control muy exhaustivo de la microbiota que realizará la fermentación y la elección correcta de la estrategia de inoculación.

Esta revisión se centra en resumir una considerable cantidad de investigación que se ha dirigido en los últimos años hacia la mejora de la eficiencia y la fiabilidad de la FML en condiciones difíciles, especialmente en vinos que presentan niveles de pH extremos, muy altos o muy bajos. Se discuten los impedimentos para el desarrollo de la FML y se presta atención a cómo mejorar el éxito de la misma a través de diferentes estrategias de inoculación y mediante el uso de diferentes especies microbianas. También se proporciona una actualización de cómo se puede usar esta información para mejorar los resultados sensoriales durante la FML y sugerencias para futuras prioridades de investigación en este campo.

Estrategias para llevar a cabo la fermentación maloláctica en vinos con pH elevado

Debido al cambio climático, el pH del vino ha aumentado gradualmente durante los últimos años y los vinos con niveles de pH superiores a 3,5–3,6 son cada vez más frecuentes. La fuerte disminución de la acidez total en los vinos tiene un gran impacto en la calidad del mismo, generando defectos en la calidad sensorial (por ejemplo, sabor menos ácido, cambios en el color, etc.) y favoreciendo el crecimiento de microorganismos no deseables (reduciendo la estabilidad del vino).^6,12

Los valores superiores a pH 3,5 favorecen el crecimiento de especies como Lactobacillus y Pediococcus spp., mientras que O. oeni tiende a dominar a valores de pH más bajos.¹⁴ Esto ha impulsado que en los últimos años numerosos autores respalden el uso de cultivos iniciadores alternativos a O. oeni para el desarrollo de la FML.^10,15,16 En la tabla 1 se muestra una descripción general de las estrategias y las especies microbianas utilizadas para desarrollar la FML en estas condiciones de pH. La especie Lactobacillus plantarum ha sido proclamada como una candidata adecuada para ser utilizada como cultivo iniciador para la FML ya que puede sobrevivir bajo condiciones de vinificación y posee muchas propiedades de interés tecnológico.¹⁷

De hecho, durante el proceso de fermentación también puede llevar a cabo una serie de reacciones metabólicas secundarias de gran importancia para la formación de aromas en vinos,^18,19 y exhibe un rango más amplio y mayor espectro de actividades enzimáticas que O. oeni.^17,20 Cinquanta et al. estudiaron el efecto del pH en dos vinos italianos (falanghina y tintilia) inoculados con O. oeni, con L. plantarum o con una mezcla 50:50 de ambos.² La duración de la FML estuvo influenciada por el pH y la cepa de BL utilizada. Ambas especies fueron capaces de completar la FML a pH 3,8, aunque no fueron capaces de completarla a pH 3,2. La cepa de L. plantarum mejoró las notas florales en los vinos blancos de falanghina y mostró un buen impacto organoléptico en los vinos tintos de tintilia, cuya intensidad sensorial se mejoró con una mezcla comercial (50:50) de O. oeni y L. plantarum.

Además se ha propuesto el uso de L. plantarum como método de acidificación biológica debido a su capacidad para producir altas concentraciones de ácido láctico.^10,21 En esta línea, numerosas investigaciones van dirigidas a la selección y caracterización de cepas de L. plantarum para ser inoculadas en mosto.^10,15,22 Una inoculación temprana en el proceso de vinificación es, además, aconsejable por la incapacidad de L. plantarum de crecer en presencia de más del 8% de etanol, de acuerdo con varios autores.^15,23 Una de las ventajas de la coinoculación levaduras-bacterias en mosto es que no se sintetiza etanol en las primeras etapas de vinificación. Por lo tanto, se puede usar una BL más sensible, como L. plantarum, en lugar de O. oeni.²⁰ Incluso a veces es posible programar la coinoculación de una mezcla de diferentes BL (L. plantarum y O. oeni) con levaduras para completar la FML de manera más rápida y segura.²⁴ Otra ventaja de usar L. plantarum es que este organismo es homofermentativo para la glucosa,²⁵ lo que evita el riesgo de aumentar la acidez volátil. La evidencia reciente sugiere el uso adicional de cepas seleccionadas de L. plantarum para la acidificación prealcohólica del mosto de uva.^{9,10,15,21,26-28} Lucio et al. realizaron una selección de cepas de Lactobacillus utilizando diversos criterios entre los que se priorizó la capacidad y eficiencia de crecimiento en mosto.¹⁰ Los resultados mostraron que cepas que crecían en mosto realizaron la FML, acidificaron el mosto, sintetizaron ácido láctico a partir de los azúcares y mostraron alta resistencia a la lisozima y al sulfuroso. Onetto et al. plantearon el uso de L. plantarum para reducir el pH a través de la acidificación del mosto previamente a la realización de la FA por parte de las levaduras.²¹ En su investigación, los azúcares disponibles fueron consumidos por las BL produciendo hasta 8,3 g/L de ácido láctico. El ácido láctico cambió el pH de 3,9 a 3,4 después de 14 días sin producirse concentraciones relevantes de ácido acético (0,34 g/L).

Una estrategia alternativa al uso de L. plantarum es la inoculación de levaduras no Saccharomyces, concretamente cepas de Schizosaccharomyces pombe para la disminución de la acidez mediante la fermentación maloalcohólica. La desacidificación biológica es posible gracias a la capacidad de esta levadura de consumir el ácido málico presente en el mosto o en el vino con la producción estequiométrica correspondiente de etanol y CO₂.^29,30 Para este objetivo, diferentes cepas de Schizosaccharomyces spp. han sido inmovilizadas en perlas de alginato,³¹ coinoculadas con S. cerevisiae o inoculadas secuencialmente.^32,33 Sin embargo, hay que tener presente también que S. pombe se considera una levadura peligrosa debido a la producción de sabores desagradables asociados a su metabolismo. S. pombe se aísla comúnmente de vinos con deficiencias organolépticas y químicas y en los que se encuentran concentraciones importantes de ácido acético, acetaldehído, acetoína y acetato de etilo.^33-35

Asimismo, es importante resaltar que en mostos de pH alto se observa un crecimiento muy rápido de microorganismos autóctonos, algunos de los cuales son considerados como microorganismos alterantes que pueden causar compuestos indeseables que afectan negativamente al vino, como por ejemplo la formación de fenoles volátiles o compuestos tóxicos para los humanos, como las aminas biógenas o micotoxinas.³⁶ Para limitar el desarrollo de esta microbiota autóctona no deseada se recomienda la coinoculación de bacterias malolácticas seleccionadas (O. oeni/L. plantarum) junto con las levaduras responsables de la FA. Para llevar a cabo esta estrategia es necesario tener en cuenta la compatibilidad de las BL con las cepas seleccionadas de levadura,^8,15,37,38 y se recomienda el empleo de cultivos iniciadores autóctonos por estar bien adaptados a las condiciones de un área vitivinícola específica.³⁹ En cuanto a O. oeni, se ha visto que la coinoculación en mosto junto a cepas compatibles de S. cerevisiae evita el desarrollo de levaduras no deseadas como Brettanomyces bruxellensis. Berbegal et al. coinocularon diferentes cepas de S. cerevisiae, levaduras no Saccharomyces y O. oeni utilizando diferentes estrategias.⁴⁰ Cuando se coinocularon S. cerevisiae y O. oeni en mosto de la variedad nero di Troia contaminado con B. bruxellensis, los resultados mostraron una disminución en 4-etil guayacol y 4-etil fenol por debajo de su umbral de percepción sensorial tras 21 días del comienzo de la FA. Curiosamente, la población de B. bruxellensis también se redujo en presencia de O. oeni.⁴⁰

Lucio et al. estudiaron las consecuencias de las interacciones de diferentes combinaciones entre dos cepas de L. plantarum y seis cepas comerciales de S. cerevisiae.⁸ Los resultados mostraron que fue posible controlar la acidez del vino coinoculando L. plantarum y S. cerevisiae. La FML se llevó a cabo con cualquier combinación BL/levadura, pero el grado de acidificación biológica dependió de la combinación de cepas utilizadas. Las investigaciones de Berbegal et al. mostraron que la coinoculación de S. cerevisiae y L. plantarum en mosto mejoraba la adaptación de las BL a las duras condiciones del vino.¹⁵ El procedimiento propuesto puede generalizarse como un método estándar para el diseño de cultivos iniciadores de MLF adaptados para mostos de pH alto.

Además del género Lactobacillus, Pediococcus sp. es capaz de realizar la FML a pH elevados. Sin embargo, algunos pediococos sintetizan polisacáridos extracelulares, lo que puede conducir a la presencia de una viscosidad anormal en el vino. Una forma de solucionar este tipo de problemas es mediante ingeniería genética. Bauer et al. clonaron el gen maloláctico de Pediococcus damnosus NCFB1832 (mleD) en S. cerevisiae.⁴¹ La cepa genéticamente modificada de S. cerevisiae fue capaz de disminuir el nivel de ácido málico en mosto a menos de 0,3 g/L en 3 días.

Por otro lado, estudios recientes muestran que la supervivencia bacteriana está más relacionada con la evolución del pH durante la FML que con el pH inicial del mosto. Lerena et al. realizaron una evaluación de la capacidad de un nuevo cultivo iniciador de L. plantarum para completar la FML a escala de laboratorio y semiindustrial.⁴² En todos los casos, los mostos mostraron valores de pH iniciales superiores a 3,6, pero el pH mostró un comportamiento dinámico, cambiando a medida que avanzaba el FML. En fermentaciones en las que el pH aumentó con el tiempo, la cepa de L. plantarum metabolizó con éxito la mayoría del ácido málico que estaba presente originalmente en el mosto. Por el contrario, cuando el pH fue disminuyendo con el tiempo, los recuentos bacterianos se redujeron, al igual que la tasa de consumo de ácido málico.

Estrategias para llevar a cabo la fermentación maloláctica en vinos con pH bajo

El uso cada vez mayor de variedades de uva de bajo pH en la vinificación y el interés en la realización de la FML en vinos blancos y espumosos hacen necesario el estudio del comportamiento de las diferentes especies de BL durante la FML, la búsqueda de nuevas estrategias de inoculación y adaptación de los cultivos iniciadores a estas condiciones de bajo pH. La tabla 2 recoge una descripción general de las estrategias y las especies microbianas utilizadas para desarrollar la FML en estas condiciones de pH.

Estos estudios hacen patente la importancia del proceso de selección del cultivo iniciador para unas condiciones determinadas. Knoll et al. investigaron el impacto de diferentes estrategias de inoculación para llevar a cabo la FML con dos cepas diferentes de O. oeni en vinos de la variedad riesling con una alta acidez (pH 2,9-3,1).⁴⁷ La estrategia de inoculación simultánea de levadura y bacteria mostró una reducción en el tiempo total de fermentación (FA y FML) en comparación con las inoculaciones secuenciales. En comparación con la inoculación secuencial, los vinos tendían a tener concentraciones más altas de ésteres etílicos y de acetato. Los resultados de este estudio ofrecen algunas alternativas para la realización segura de la FML en mostos blancos de clima frío y bajo pH y con alto contenido de alcohol.

Una segunda estrategia es proteger las células de las consecuencias del estrés causado por el pH bajo mediante la encapsulación o inmovilización de las BL. Genisheva et al. evaluaron la eficiencia de la inmovilización de células de O. oeni en diferentes soportes para la implementación de la FML en vino blanco,⁴⁸ y Simó et al. valoraron la encapsulación de O. oeni en cápsulas de sílice-alginato.^49,50 Estos estudios mostraron la protección de las células inmovilizadas contra los efectos inhibitorios del vino. Resultados positivos se han encontrado también al coinmovilizar S. cerevisiae y O. oeni en celulosa recubierta de almidón para llevar a cabo una FA y FML simultáneas⁵¹ o en perlas de alginato.⁵² La coinmovilización de S. cerevisiae y O. oeni permitió un proceso de fermentación eficiente, produciendo bajos niveles de acidez volátil y concentraciones de etanol y glicerol comparables a las obtenidas en una inoculación secuencial. La estrategia de coinmovilización generó en ambos casos una disminución significativa en el tiempo necesario para completar la FA y la FML. Otra forma de protección de las BL a las condiciones de estrés presentes en el vino es mediante el uso de glutatión para la recuperación del equilibrio rédox celular.⁵³ A pesar de la incapacidad de O. oeni para sintetizar glutatión, esta bacteria puede asimilarlo del medio aumentando los ácidos grasos de ciclopropano en la membrana celular, tanto en la fase exponencial como en la estacionaria, lo que genera una mayor supervivencia de la bacteria en condiciones de estrés.

«Se podría usar la evolución dirigida como una herramienta para generar cultivos iniciadores de FML más eficientes, diseñados para vinos con múltiples factores de estrés como es el pH bajo.»

Con el fin de generar cepas de O. oeni capaces de llevar la FML en condiciones de estrés (alta concentración de etanol, bajo pH), Jiang et al. diseñaron una estrategia de evolución dirigida a partir de un cultivo continuo de esta bacteria.⁵⁴ Se cultivaron diferentes cepas de O. oeni durante 350 generaciones en un ambiente similar al vino tinto en el que se iban aumentando los niveles de factores de estrés. Los resultados mostraron que tres cepas fueron capaces de finalizar la FML en 160 h, en condiciones de etanol de 15,1% (v/v), 26 mg/L de SO₂ a pH 3,35, mientras que la cepa original no fermentó más de dos tercios del ácido L-málico presente en el medio. Estos hallazgos demuestran la posibilidad de usar la evolución dirigida como una herramienta para generar cultivos iniciadores de FML más eficientes, diseñados para vinos con múltiples factores de estrés como es el pH bajo.

Diversos autores proponen como alternativa a O. oeni el uso de cepas de L. plantarum y varios estudios han demostrado la capacidad de L. plantarum para crecer eficientemente a pH bajo.^55-60 Por ejemplo, García-Alegría et al. describieron que varias cepas de L. plantarum aisladas de vinos tintos de la DO Rioja pudieron crecer con éxito en medio MLO a pH 3,2 y alcanzar concentraciones celulares similares a los de las cepas de O. oeni.⁶⁰ Iorizzo et al. llevaron a cabo la caracterización tecnológica de 11 cepas de L. plantarum aisladas de vinos del sur de Italia.⁵⁷ Estas cepas se caracterizaron según sus propiedades enológicas, su capacidad para producir aminas biógenas y bacteriocinas, su respuesta a la presencia de compuestos fenólicos, sus actividades enzimáticas, etc. Finalmente, se evaluó la actividad maloláctica en la variedad cabernet sauvignon, utilizando dos métodos de inoculación, demostrando que la cepa de L. plantarum seleccionada no producía aminas biógenas, mostraba una buena resistencia al pH bajo y etanol elevado, y tenía buenas actividades maloláctica y beta-glucosidásica. Succi et al. exponen además que la adaptación L. plantarum a condiciones de estrés subóptimas producen una mejora de la tolerancia al mismo estrés pero en condiciones más extremas.⁶¹ De hecho, algunas cepas mostraron una mejora en el µmáx cuando se expusieron a condiciones de estrés por ácido (pH 3,5) o etanol (8%) después de una adaptación a largo plazo a pH 5,0 o con 2% de etanol, respectivamente. Por otro lado, investigaciones recientes sugieren el uso de cepas de Pediococcus spp. en la vinificación. No obstante, también resaltan la falta de comprensión de los factores que influyen en el crecimiento y su potencial para causar alteraciones en el vino.¹⁶

Conclusiones

Gracias a las continuas investigaciones, actualmente poseemos una mejor comprensión de cómo la FML puede usarse para influir en el estilo del vino que se desea producir. La elección de la cepa de BL y el momento de la inoculación bacteriana son cruciales para poder realizar la FML y sobre todo en vinos con pH extremos. Además, un buen control de esta fermentación permite intervenir y modular las características sensoriales de los vinos.¹ Las investigaciones futuras deben centrarse en aumentar el conocimiento de la diversidad microbiana, de las diferentes capacidades de resistencia a condiciones de estrés que tienen las diferentes cepas y las diferencias sensoriales que pueden aportar a través de la metabolómica^62,63 y la genómica.^64,65

Del mismo modo es interesante el estudio del origen geográfico de las cepas para la selección de cultivos iniciadores malolácticos resistentes a pH extremos.^66,67 Además de poder seleccionar cepas adaptadas a las condiciones de un determinado estilo de vino, la inoculación de cepas autóctonas permite poner en valor el concepto de terroir.⁶⁸ Sin embargo, el aislamiento de cepas potencialmente más adecuadas para el clima de una región en particular y las estrategias y condiciones de inoculación no se han estudiado en profundidad. Siguen haciendo falta nuevas investigaciones para encontrar cepas adecuadas para todas las condiciones y variedades de uva.¹

En los últimos años se han buscado estrategias alternativas a la inoculación secuencial de O. oeni tras la FA para llevar a cabo la FML en vinos con condiciones difíciles. El uso de especies como L. plantarum, P. damnosus o S. pombe es un área en creciente desarrollo y existen ya numerosos cultivos iniciadores comerciales.^8,15,16,30

Por otro lado es necesario continuar las investigaciones sobre el efecto sinérgico de los diferentes factores de estrés que se encuentran en el vino y por qué algunas cepas se ven más afectadas que otras ante diferentes niveles de pH. Es imprescindible seguir evaluando fisiológica y metabólicamente los mecanismos de tolerancia a la toxicidad en las BL y los cambios de integridad de la membrana plasmática ante el estrés causado por pH bajos.

Por último, es necesario seguir aumentando el conocimiento a nivel genómico y transcriptómico de la especie O. oeni. Todavía no se han desarrollado sistemas de transformación ni es posible modificar la presencia y expresión génica en esta bacteria. La capacidad de ejecutarlo ayudará a delinear rápidamente las rutas metabólicas y sistemas de respuesta al estrés y se podrán desarrollar métodos para mejorar, por ejemplo, la expresión de los genes implicados en la FML ante determinadas condiciones de vinificación.

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