La cromatografía de líquidos (HPLC, de High Performance Liquid Chromatograhpy), a pesar de sus grandes posibilidades y aplicaciones, no es una herramienta habitual en los laboratorios enológicos dedicados al control del proceso productivo. Los motivos son varios, entre los más importantes se encuentran el coste del equipamiento, la adecuación de la información que suministra a las necesidades del enólogo y la inmediatez de la misma. Aunque donde sí ha sido una herramienta importante es en la investigación enológica, como se muestra en la figura 1, donde vemos que en la última década se ha publicado una media de 133 artículos al año donde se usa la HPLC en análisis de uvas, vinos, vinagres o brandies.
Si analizamos estos artículos según la muestra analizada en los mismos (fig. 2), nos encontramos que el vino ha sido el producto que recibe la mayor atención, representando el mayor número de trabajos, casi la mitad del total. Obviamente como producto final, la determinación de su composición y del efecto de las prácticas enológicas ha recabado la mayor atención entre los trabajos publicados. El estudio de los cambios durante los procesos de fermentación alcohólica es el siguiente objeto de interés en los análisis cromatográficos. Las determinaciones por cromatografía de líquidos de parámetros de interés en uvas representan casi el 20% del total de trabajos publicados. Finalmente, las determinaciones sobre otras muestras, como son vinagres y brandies, representan un porcentaje minoritario.
En el caso de los parámetros determinados, la gran mayoría de los estudios se han dedicado a la puesta a punto de métodos o determinaciones de compuestos de tipo fenólico, como se puede ver en la figura 3, llegando casi a las tres cuartas partes del total de trabajo. Dentro de estos trabajos, destacan por número los dedicados a los antocianos, más de la mitad de los trabajos desarrollados, y aquellos donde se determina entre otros el resveratrol y sus derivados, que alcanzan casi la cuarta parte del total de trabajos.
Con mucha menor dedicación se encuentra trabajos dedicados a los métodos de análisis y determinaciones de ácidos orgánicos, azúcares y aminas. Apareciendo además de forma individual con un número de trabajos similar a los anteriores grupos, la ocratoxina A, sobre todo en los últimos 5 años.
Para finalizar esta breve revisión temática, creemos interesante destacar el origen de los trabajos, recogido en la figura 4. Puede comprobarse como la contribución de nuestro país al desarrollo de los métodos cromatográficos de interés en enología es con diferencia la de mayor importancia a nivel mundial. En la figura 4 se presentan los datos correspondientes a los 24 países de con mayor contribución a estas temáticas que en conjunto representan casi el 50% de las publicaciones analizadas. Tenemos que entender que este resultado se debe a la doble contribución de la importancia de la enología en nuestro país, por un lado, y a la difusión de los sistemas cromatográficos en nuestros laboratorios de investigación, por otro.
Revisando la figura, puede sorprender la contribución de los investigadores chinos en estos aspectos, la explicación de este hecho hay que buscarla sobre todo, en el desarrollo de métodos para la determinación de compuestos con marcado poder antioxidante en uvas, tema sobre el que versan gran parte de sus contribuciones.
En cuanto a la aplicabilidad de los métodos cromatográficos como herramienta en las bodegas, salvo excepciones, los enólogos no se ven en la necesidad de interpretar los resultados producidos por esta técnica. Cuando decimos interpretar, queremos decir justamente el proceso que tiene que desarrollar el enólogo para poder aprovechar los resultados de los análisis. Esta necesidad no surge del hecho de que sean resultados poco específicos o complejos, antes al contrario, son resultados totalmente específicos y expresados en unidades simples como pueden ser los miligramos por litro o incluso en gramos por hectolitro, si así se demanda. La necesidad de interpretación se debe a que en la mayoría de los casos, la información suministrada por los análisis cromatográficos es tan abundante que precisa de un periodo de interpretación posterior para poder sacarle el máximo provecho. Esta situación solo se evita en los casos en los que la información requerida se refiere al valor de un parámetro, o conjunto de parámetros, concretos de interés especial, como puede ser el análisis individualizado de azúcares, ácidos orgánicos de cadena corta, de antocianos, etc. ya que en un único cromatograma se puede obtener el análisis de todas las especies presentes en el mosto o vino.
Esta situación entendemos que es una de los mayores impedimentos para la extensión de los cromatógrafos de líquidos en los laboratorios de las bodegas. Por otro lado, hoy día, ni el precio de equipos (básicos) ni la preparación necesaria de los técnicos que los manejen, podría considerarse una limitación para la extensión de su uso.
Por tanto, centrándonos en el último aspecto, la inmediatez de la información, el uso de la HPLC debe justificarse en base a la obtención de una información útil para el enólogo en sus labores de elaboración. La utilidad de la información debe entenderse como información que permita el incremento de la calidad del producto final, a un coste asumible por la empresa. Básicamente, estaría en unos tiempos dónde la respuesta a la necesidad de información sí que serían los adecuados para realizar las acciones correctoras necesarias en tareas de producción.
En este sentido es en el que se prepara la información que se presenta en este artículo, de forma que más allá de ser una revisión de las aplicaciones de la cromatografía líquida en enología, se pretende poner de manifiesto, mediante ejemplos concretos, cómo el enólogo podría obtener información útil para su trabajo, en el aspecto específico de la inmediatez de la información generada.
Desde hace unos veinte años, la introducción de nuevas fases estacionarias en las columnas cromatográficas permitió eliminar, en muchos casos, la necesidad de las etapas de preparación de muestras, reduciendo la aplicación de técnicas de extracción líquido-líquido o de extracción en fase sólida (SPE), disminuyendo con ello tanto el tiempo como el costo de los análisis. Un ejemplo de este aspecto se presenta en la figura 5, donde se recogen los cromatogramas obtenidos con y sin extracción en fase sólida de un vino blanco (Chilla y col, 1996). Pueden observarse diferencias entre los cromatogramas, consecuencias de los diferentes niveles de recuperación en la extracción en fase sólida, pero la principal diferencia se encuentra en los tiempos totales de análisis (80 min/muestra para HPLC directa vs 120 min/muestra para SPE-HPLC) y también en los costes (5 euros/muestra para HPLC frente a 15 euros/muestra para SPE-HPLC), sin incluir los costes de personal asociados a la preparación de las muestras ni amortización de equipos.
Así pues, esta mejora en las técnicas de análisis se traduciría de forma directa en una información más útil para el enólogo, obviamente no porque se haya generado una información distinta, sino porque es posible obtenerla en un tiempo más adecuado para las necesidades de las bodegas.
En los años noventa se introdujeron las primeras columnas de tipo monolítico, que permitían realizar análisis empleando flujos de fase móvil hasta diez veces superiores a los tradicionales, manteniendo niveles de resolución cromatográfica similares a los obtenidos con columnas tradicionales. Este tipo de columnas permite, por tanto, reducir hasta del orden de diez veces los tiempos necesarios para desarrollar los análisis cromatográficos. Un ejemplo de la aplicación de este tipo de columnas se muestra en la figura 6, donde se presenta el cromatograma obtenido a partir de un mosto de uva tinta en la determinación del resveratrol (Piñeiro et al. 2006). En este caso el análisis se desarrolló de forma específica para la determinación de este compuesto. Puede comprobarse que se puede realizar la determinación en menos de 2 minutos.
Finalmente, el último gran avance en cromatografía líquida, en lo que se refiere e velocidad de la determinación, ha sido la introducción en los laboratorios de los sistemas de ultracromatografía (UPLC, de Ultra Performance Liquid Chromatography), que trabajando a presiones entre 4 y 6 veces superiores a las habituales, permiten separaciones entre 5 y 10 veces más rápidas que las obtenidas en los sistemas tradicionales. Estos sistemas se están implantando en los últimos años en los laboratorios, tanto por el ahorro en tiempo de análisis como por la reducción de reactivos y generación de residuos. Este último punto es su principal ventaja frente a los métodos basados en columnas monolíticas, puesto que estos últimos utilizan el incremento de la velocidad de flujo de fase móvil para incrementar la velocidad del análisis, incrementando por tanto el consumo de disolventes y la, consiguiente, generación de residuos.
En la figura 7 se presenta el resultado de la separación de compuestos de tipo fenólico en brandies así como el cromatograma obtenido en un sistema tradicional (Schwarz y col. 2009). Puede comprobarse como se puede obtener la misma información en un tiempo 14 veces menor. Con los sistemas de ultracromatografía se pueden suministrar los datos necesarios para tomas de decisiones en tiempos adecuados, es decir, estos sistemas pueden generar una información útil para el enólogo en tareas de producción.
En cualquier caso, los avances en cromatografía líquida sí que ya han producido resultados de interés en investigación en enología, puesto que en estos aspectos sí que interesa obtener la mayor cantidad de información posible con el fin de explicar los fenómenos que ocurren o pueden ocurrir durante la elaboración de los vinos y productos derivados. Ejemplos de estas aplicaciones son los resultados mostrados en la figura 8.
El cromatograma presentado en la figura 8 muestra un análisis de compuestos de la familia de los antocianos empleando un sistema de ultracromatografía frente a los resultados del análisis empleando un sistema de cromatografía tradicional (Liazid et al., 2011). Como puede comprobarse se puede obtener la misma información empleando un tiempo 6 veces inferior mediante el sistema de ultracromatografía. Esto permitiría que un enólogo pudiera seguir la evolución de los diferentes antocianos en maduración o en fermentación casi online, puesto que además no es necesaria una etapa analítica previa al análisis cromatográfico, tan solo la filtración de la muestra.
En definitiva, estas variantes de la técnica de HPLC clásica, bien las columnas monolíticas o bien los sistemas de ultracromatografía, pueden suplir una de las carencias más importantes de la HPLC para el enólogo, la rapidez en la producción de los resultados, de forma que los mismos pueden ser realmente útiles en el trabajo del enólogo. Queda aún por solventar el segundo gran problema, lo que puede ser una sobresaturación de la información, pero ese aspecto es intrínseco a la propia técnica y debe ser abordado con otras herramientas de tratamientos de datos adecuadas.
Bibliografía
Chilla, C., Guillén, D.A., Barroso, C.G. y Pérez-Bustamante, J.A. (1996). Automated on-line solid-phase extraction-high-performance liquid chromatography-diode array detection of phenolic compounds in sherry wine. Journal of Chromatography A 750: 209-214.
Liazid, A., Guerrero, R.F., Cantos, E., Palma, M. y Barroso, C.G. (2011). Microwave assisted extraction of anthocyanins from grape skins. Food Chemistry 124: 1238-1243.
Piñeiro, Z., Palma, M. y Barroso, C.G. (2006). Determination of trans-resveratrol in grapes by pressurised liquid extraction and fast high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A 1110: 61-65.
Schwarz, M., Rodríguez, M.C., Guillén, D.A. y Barroso, C.G. (2009). Development and validation of UPLC for the determination of phenolic compounds and furanic derivatives in Brandy de Jerez. Journal of Separation Sciences 32: 1782-1790.
