Los productores de vinos deben seguir ciertos pasos en el proceso de limpieza y desinfección de sus bodegas y equipos para cumplir con las pautas y modelos de calidad exigidos. La ley que regula la elaboración de vinos y el cumplimiento de estándares y normas de calidad demandados por los mercados compradores, ha llevado al establecimiento de manuales y procedimientos que van desde guías de buenas prácticas, hasta el desarrollo de sistemas de APPCC (Aplicación del sistema de análisis de riesgos y control de puntos críticos en vinos) y de certificaciones como ISO 9001 e ISO 14000. En el Reglamento Sanitario de los Alimentos se señala que la limpieza consiste en eliminar los residuos visibles, como polvo, tierra y grasa y que una buena higienización comprende la reducción de los microorganismos, pero no se especifican concentraciones máximas permitidas de estos últimos en vinos elaborados.1
La importancia del control microbiológico
En la industria enológica, tradicionalmente se ha dado poca importancia al control microbiológico de los vinos embotellados, en parte porque los microorganismos existentes no suponen un riesgo grave sobre la salud, y en parte porque no hay legislación específica al respecto.* De cualquier forma, el enólogo es consciente de que la presencia de microorganismos vivos puede producir alteraciones sobre todo en aquellos vinos con un alto contenido en azúcares residuales. Por ello, se han introducido técnicas como la microfiltración para garantizar la estabilidad microbiológica del vino embotellado. En la actualidad, las pocas referencias que existen sobre concentraciones aceptables de microorganismos en vinos embotellados, son sólo recomendaciones o hacen referencia a límites establecidos por los países importadores.2
Los objetivos de nuestro trabajo han sido mostrar la eficacia de los tratamientos de filtración para garantizar la estabilidad microbiológica y conocer cuál es la incidencia de los microorganismos en vinos embotellados. Ello permitirá recopilar datos que pueden ser de utilidad para el establecimiento de una normativa microbiológica y de protocolos que garanticen la salud del consumidor y la estabilidad del producto.
Para realizar un correcto control microbiológico del vino en la etapa del embotellado, se debería acordar con el enólogo o responsable de las líneas, el realizar un muestreo a distintos tiempos durante el proceso de embotellado con el objetivo de acotar el lugar donde está el posible punto de contaminación y procurar así una rápida solución correctora.
Metodología
En nuestra línea de investigación enológica analizamos diferentes tipos de vinos secos (jóvenes, crianzas y reservas) de bodegas de diferentes denominaciones de origen (DO), estudiando la población microbiana antes (vino base) y después de la microfiltración (vinos embotellados). En este caso, microfiltración se entiende por filtración con filtros secuenciales de tamaño de poro decreciente, con un poro final de 0,45 micrómetros.
Las muestras directas, diluidas o concentradas en función de la carga microbiana presente, se sembraron en placas de MRS (Scharlab) y MLO para el aislamiento de bacterias lácticas,3 GPYA para el de levaduras4 y CA sin CaCO3 para el de bacterias acéticas. Las placas se incubaron a 28 ºC durante dos a siete días. La identificación de las bacterias lácticas y acéticas se realizó mediante la técnica del 16S-ARDRA. El fragmento amplificado se digirió por separado con los enzimas MseI, BfaI y AluI y los fragmentos del gen 16S rRNA digeridos se separaron por electroforesis en agarosa 2 %, como describieron Rodas et al. (2005) y Blasco et al.5,6 La identificación de las levaduras se realizó mediante restricción (CfoI, HaeIII y HinfI) de ITS, según el procedimiento de Esteve-Zarzoso et al.7 Los perfiles de restricción de los aislados fueron comparados con perfiles de cepas de referencia en nuestra base de datos y en la base Bd_levaduras de UVEG-CSIC.
Resultados
Hemos verificado que el proceso de filtración mediante los sistemas de filtros empleados más comúnmente en bodega garantiza la eliminación de la mayor parte de levaduras en el vino base pero no de la totalidad de las bacterias (tabla 1). Aunque se aprecian disminuciones importantes en los recuentos de bacterias viables tras la filtración, la cantidad de estas bacterias residuales puede ser lo suficientemente significativa como para dar lugar a alteraciones posteriores: refermentaciones en botella o bag-in-box, turbidez, abombamiento en el caso de los envases bag-in-box, etc.
La mayoría de estas alteraciones son causadas principalmente por levaduras de las especies Saccharomyces y Zygosaccacharomyces como se muestra en la tabla 1. Las alteraciones llevadas a cabo por microorganismos son favorecidas por una serie de parámetros del vino: una baja concentración de etanol (con menos de 11 º de alcohol, las bacterias y especialmente las levaduras se desarrollan sin ninguna dificultad), niveles de sulfuroso bajo (aditivo utilizado en enología como antimicrobiano y antioxidásico sujeto a reglamento), ausencia de pasteurización o mala pasteurización en vinos semidulces (mistelas, moscateles, vinos con azúcar residual…), azúcares residuales, etc.
Las especies de levaduras identificadas en vinos embotellados aparecían ya en el vino base, aunque la diversidad presente tras la filtración es menor como consecuencia de la disminución en su concentración. Las únicas bacterias aisladas en vinos filtrados y embotellados pertenecen a la especie Acetobacter aceti, una de las responsables del aumento de la acidez volátil en vino, mientras que en vinos base jóvenes, aparecía también Oenococcus oeni, bacteria responsable de la fermentación maloláctica.
Tabla 1 Especies de levaduras, bacterias lácticas y bacterias acéticas encontradas en vinos secos jóvenes, crianzas y reservas antes y después del filtrado de los vinos en las respectivas bodegas. Se indican los niveles de recuento de cada grupo de muestras antes y después de las filtraciones en forma de UFC/mL
| Tipo de Muestras |
Jóvenes |
Crianzas |
Reservas |
|
Recuentos de levaduras en vino base (UFC/mL) |
1,2 x 10-1 – 1,2 x 103 |
7,2 x 10-1 – 7,8 x 103 |
3,0 x 10-1 – 4,0 x 102 |
|
Especies de levaduras identificadas en vino base |
|
Pichia membranaefaciens |
Pichia membranaefaciens |
|
Recuento de bacterias en vino base (UFC/mL) |
7 – 3,6 x 105 |
1,8 x 101 – 7,7 x 103 |
2 – 8,1 x 105 |
|
|
|
|
|
|
Recuento de levaduras en vinos filtrados (UFC/mL) |
< 1 x 10-2 – 5 |
< 1 x 10-2 – 8 x 10-2 |
< 1 x 10-2 – 2 x 10-2 |
|
Especies de levaduras identificadas en vinos filtrados |
|
|
|
|
Recuento (UFC/mL) de bacterias en vinos filtrados |
< 1 x 10-2– 1,2 x 104 |
3,6 x 10-1– 7,8 x 103 |
< 1 x 10-2– 1,1 x 103 |
|
Especies de bacterias identificadas en vinos filtrados |
Acetobacter aceti |
Acetobacter aceti |
Acetobacter aceti |
La microfiltración parece retener mejor las células de Oenococcus oeni que las de bacterias acéticas, posiblemente porque las primeras forman cadenas de células que son retenidas mejor por los filtros. Los recuentos de microorganismos y especies encontrados antes y después del filtrado se muestran en la tabla 1.
Hemos observado también que las alteraciones más importantes se producen lógicamente en vinos con cantidades importantes de azúcar residual, ya que los microorganismos cuentan con reservas suficientes para producir no solamente turbidez sino también gas en grandes cantidades. Así, es relativamente frecuente la aparición de refermentaciones en bag-in-box con vinos dulces que comprometen la calidad del producto y el éxito de la exportación.
Las conclusiones a las cuales hemos llegado tras los resultados obtenidos en nuestro trabajo se pueden resumir en los siguientes puntos principales:
- La microfiltración reduce la carga microbiana, particularmente la de levaduras y Oenococcus oeni hasta en 10-5 veces, pero aún existen concentraciones de bacterias acéticas en vinos microfiltrados que pueden comprometer la calidad del vino embotellado ya que se reducen como máximo solamente en 10-3 veces. Dicho de otra forma, pasaría al menos una de cada 100 000 células de levadura o una de cada 1000 células de bacterias acéticas. Estas reducciones de número en ocasiones son mucho menores, llegando incluso a traspasar casi todas las bacterias.
- La especie bacteriana que encontramos mayoritariamente en vinos filtrados y embotellados es Acetobacter aceti, especie causante de un aumento de la acidez volátil en vino, parámetro que está legislado, y que debemos tener en consideración ante la posible presencia de este microorganismo como responsable de la alteración de la calidad del vino.
- Se observa la necesidad inaplazable por parte de organismos como la FAO, OMS, OIV… de legislar e implantar un sistema de control microbiológico en vinos terminados y en la línea de embotellado que especifique número y especie de microorganismos finales autorizados en cada tipo de vino.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por los proyectos AGL2006-08495/ALI y RM2007-00007-00-00. Agradecemos a la UVEG-CSIC el acceso a Bd_levaduras.
Notas:
* En todo control microbiológico de calidad destacan dos aspectos: la calidad higiénico–sanitaria cuyo objetivo es que no se distribuyan microorganismos patógenos para la salud, y la calidad comercial, que consiste en detectar la presencia de microorganismos alterantes, que adulteren el producto haciéndolo no comestible (aunque no sean patógenos como es el caso de las levaduras o bacterias acéticas).
Bibliografía
- Molina, R.; Díaz, V.: «Sanitización en la industria enológica», Bebidas Mexicanas 2006; Agosto-Septiembre: 8-12.
- Loureiro, V.: «Alteraciones microbianas de los vinos», IX Congreso Nacional de Investigación Enológica: Transferencia de Resultados al Sector Vitivinícola, 2007.
- Maicas, S.; Natividad, À.; Ferrer, S.; Pardo, I.: «Malolactic fermentation in wine with high densities of non-proliferating Oenococcus oeni», World Journal of Microbiology and Biotechnology 2000; 16: 805-810.
- Belloch, C.; López, L.; Esteve, B.; Martínez, P.V.; García, M.D.; Uruburu, F. (Eds): Catálogo de cepas de la Colección Española de Cultivos Tipo. 1998.
- Rodas, A.; Ferrer, S.; Pardo, I. et al.: «Polyphasic study of wine Lactobacillus strains: taxonomic implications»,International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2005; 55: 197-207.
- Blasco, L.; Pardo, I.; Ferrer, S.: «Comparison between 16S-ARDRA, specific PCR and FISH for identification and quantification of acetic acid bacteria from grape must and wine», International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2008 (enviado).
- Esteve-Zarzoso, B.; Belloch, C.; Uruburu, F.; Querol, A.: «Identification of yeast by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers», International Journal of Systematic Bacteriology 1999; 49: 329-337.
