Actualmente se observa por parte de los consumidores un incremento en la demanda de vinos con bajos niveles de alcohol (etanol) y preservantes químicos. Vinos desalcoholizados o con reducido contenido de alcohol han estado disponibles en el mercado por más de 30 años. Este tipo de productos favorece tanto a los consumidores prudentes que no desean la ingesta elevada de alcohol como a los productores por el ahorro impositivo que les representa.
Durante este período, la industria enológica implicada ha estado desarrollando y evaluando diferentes estrategias para reducir el contenido de etanol evitando comprometer la calidad del producto final. Numerosos procesos tecnológicos han sido utilizados para eliminar o reducir el alcohol en vino, como por ejemplo: evaporación, destilación, uso de membranas, absorción, extracción química, fermentación parcial y centrifugación. Por lo general estas técnicas de extracción son poco selectivas y alteran el contenido de algunos compuestos aromáticos como ésteres y aldehídos, imponiendo nuevos pasos en el proceso de producción para corregir la calidad del producto final. Además, estos procesos requieren por lo general prácticas intensas y equipamientos que no están al alcance de todas las bodegas.
Es internacionalmente reconocido el uso de cepas seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae como arrancadoras de la fermentación vínica, actuando principalmente en una eficiente transformación de los azúcares del mosto en metabolitos como el etanol. Conjuntamente, la actividad metabólica de la levadura produce componentes esenciales para la estructura organoléptica del vino tales como alcoholes superiores, ácidos grasos y ésteres. Las diferentes cepas de levadura genéticamente modificadas desarrolladas para intentar reducir el etanol producido durante la fermentación vínica pueden agruparse bajo los siguientes campos de estudio: la ingeniería metabólica de levaduras y la reducción de los azúcares fermentables del mosto.
Ingeniería metabólica de levaduras
Esta estrategia se basa en el redireccionamiento metabólico de los azúcares del mosto reduciéndose la producción de etanol e incrementando la biomasa celular o los productos finales de fermentación como el glicerol o el ácido láctico (fig. 1). Uno de los primeros intentos de construir cepas transgénicas para reducir el contenido etílico del vino fue realizado por Dequin y colaboradores (1999), sobreexpresando en un plásmido multicopia el gen que codifica para el enzima lacticodeshidrogenasa (LDH) de Lactobacillus casei en la cepa vínica V5 de S. cerevisiae. La enzima LDH corresponde a la categoría de oxidorreductasas, dado que cataliza una reacción redox en la que el piruvato es reducido a ácido láctico (lactato) gracias a la oxidación de NADH a NAD+ (fig. 1).
S. cerevisiae, generalmente, produce trazas de ácido láctico durante la fermentación alcohólica debido a la ineficiencia de su propia LDH localizada en la mitocondria. La cepa de levadura portadora de la LDH bacteriana se utilizó para fermentar cinco mostos naturales diferentes (chardonay, macabeu, merlot, cabernet y syrah o syraz) conteniendo concentraciones desde 2,6 hasta 8,6 g/L de lactato. Se pudo observar, para dos mostos con valores de pH de 3,36 y 3,75, una reducción respecto a las fermentaciones de referencia, de 0,17 y 0,27 unidades de pH respectivamente como resultado de la producción de 5 g/L de ácido láctico por parte de la levadura genéticamente modificada. La reducción de etanol final observado en los vinos producidos con las cepas transgénicas no fue superior a un 0,25 % del producido por las cepas de referencia. La diferencia obtenida en contenido de etanol se explicó como el resultado del redireccionamiento del flujo metabólico carbónico hacia la producción de ácido láctico. Estas cepas transgénicas han mostrado una aplicación potencial para corregir mostos faltos de acidez. Desafortunadamente para lograr un decrecimiento significativo en el contenido final de etanol las cantidades de lactato que se deberían producir, cuyo descriptor es el aroma a café, impactarían de forma negativa en la calidad final del vino.
El mismo grupo de investigadores ha desarrollado una serie de cepas vínicas transformantes sobreexpresando, en un plásmido multicopia, el gen GPD1 propio de la levadura que codifica para la oxidoreductasa glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPD). La reducción del intermediario de glicólisis dihidroxiacetona fosfato a glicerol-3 fosfato por intervención de la GPD genera glicerol 3-fosfato y la subsiguiente desfosforilación del mismo le permite a la levadura sintetizar glicerol (fig. 1). Las fermentaciones de mostos sintéticos utilizando estas levaduras genéticamente modificadas presentaron hasta 2,5 veces más glicerol que aquellas realizadas con las cepas no modificadas. Desafortunadamente, el exceso de disponibilidad de NAD+ producido por la sobreactividad de GPD resultó en estímulo de las vías metabólicas de síntesis de metabolitos, que no aseguran la calidad del vino, como acetoína, butanodiol y acetato (fig. 1).
En un trabajo posterior (2006) los autores intentaron reducir el pool de NADH intracelular de la cepa vínica de S. cerevisiae V5 mediante la expresión de la NADH oxidasa (noxE) de Lactococcus lactis en un vector multicopia. Esta oxidasa cataliza simultáneamente la oxidación de NADH y la reducción de O2 formando H2O como producto final. Las cepas genéticamente modificadas mostraron una reducción drástica de la concentración total de NADH alterando numerosas reacciones de oxidorreducción de diferentes vías metabólicas. La fermentación de mosto sintético con la cepa que sobreexpresa noxE en condiciones de microoxigenación presento una reducción del 15 % del rendimiento de etanol respecto a las fermentaciones realizadas con la cepa V5 silvestre. Al mismo tiempo la cepa transformante presentó deficiencias de crecimiento durante la fermentación, así como la imposibilidad de fermentar mas de 100 g/L de glucosa. Estas alteraciones fueron correlacionadas con la acumulación intracelular de acetaldehído resultante de la interrupción del flujo metabólico a nivel del alcohol deshidrogenasa.
Un modelo alternativo para el desarrollo de una cepa vínica con bajo rendimiento en metabolitos primarios fue propuesto por Henricsson y colaboradores (2005). La expresión de una proteína modificada, combinación de dos mitades de los transportadores predominantes de glucosa y fructosa Hxt-1 y -7 de S. cerevisiae (fig. 1), en la cepa vínica V5, presentó un fenotipo respiratorio solamente en ausencia de oxígeno. Esta cepa genéticamente modificada muestra un redireccionamiento del 70 % de los azúcares del metabolismo fermentativo hacia un metabolismo respiratorio, incrementándose en un 85 % el rendimiento de biomasa respecto de la cepa de referencia V5 no modificada. Este cambio en el flujo del metabolismo del carbono fue atribuido al control ejercido por este transportador de alta afinidad por glucosa sobre el ritmo de glucólisis que no se observó para las mismas condiciones fisiológicas en la cepa de referencia. La cepa vínica creada por ingeniería genética fue evaluada en medios de cultivo sintético conteniendo hasta un máximo de 5 % de glucosa. A las 40 horas de fermentación se registraron valores de 3 g/L de etanol y 0,02 g/L de glicerol a diferencia de los 15 g/L y 1.5 g/L respectivamente obtenidos en la fermentación realizada con la cepa de referencia para las mismas condiciones. Momentáneamente la excesiva producción de biomasa y los bajos valores de glicerol obtenidos con esta cepa metabólicamente modificada por ingeniería genética no hacen de este organismo un instrumento viable en la producción de vino, pero sin duda abre la puerta a la posibilidad de estudios futuros para desarrollar cepas vínicas productoras de vinos desalcoholizados.
Reducción de los azúcares fermentables del mosto
La cosecha de uvas en un estado temprano de desarrollo y su subsiguiente vinificación resultará en un vino con reducido contenido en alcohol, pero los aromas de fruta no madura y los niveles altos de acidez serán negativos para la obtención de un producto de calidad. La supresión parcial o total de los azúcares fermentables del mosto de uvas completamente maduras permitirá reducir la cantidad de etanol en el producto final de fermentación sin comprometer los parámetros de calidad. Una de las técnicas más utilizada usando este razonamiento está relacionada con el tratamiento enzimático del mosto con la glucosa oxidasa (GOX) de Aspergillus niger (GRAS), que es una deshidrogenasa aerobia que cataliza la oxidación de la glucosa a gluconolactona en presencia de oxígeno molecular. Subsiguientemente, la gluconolactona se hidroliza espontáneamente en presencia de agua para formar ácido glucónico que para la levadura no es un sustrato fermentable. Teniendo en cuenta esta práctica ya corriente en el tratamiento de mostos de fruta se propuso recientemente una cepa transgénica de S. cerevisiae capaz de expresar y secretar una GOX recombinante de A. niger durante el proceso de fermentación alcohólica (Malherbe y colaboradores, 2003). La vinificación del mosto chardonnay realizado con la levadura genéticamente modificada mostraba una reducción de hasta el 2 % del contenido de etanol respecto del vino obtenido con la cepa no modificada. Además, los transformantes capaces de segregar la enzima GOX activa mostraron actividad bactericida durante la fermentación del mosto y en placa (fig. 2). Este efecto puede ser explicado por el hecho de que uno de los productos de la reacción mediada por GOX es el peróxido de oxigeno (H2O2). El H2O2 es conocido como un agente tóxico para las bacterias gram-positivas y negativas. Los resultados presentados por este grupo son un punto de partida para el desarrollo de cepas vínicas de arranque que favorecen la reducción de los niveles de preservantes químicos y de alcohol en vino.
Estos estudios preliminares nos permiten concluir que algunas de las levaduras metabólicamente modificadas por ingeniería genética aquí presentadas podrán ser utilizadas para la reducción de alcohol en vino o bien para la obtención de vinos desalcoholizados sin incidir aparentemente de forma negativa en la calidad del producto final. No obstante es necesario un estudio intensivo del posible impacto en las características organolépticas de los vinos obtenidos con estas cepas vínicas. Estas futuras investigaciones aportarán la información necesaria para mejorar la eficiencia del proceso sin poner en riesgo la calidad del vino y la salud de los consumidores. No obstante muchos son los obstáculos relacionados con el conocimiento científico, técnico, de mercado, de seguridad alimentaría y éticos que deberán ser solventados antes de que se puedan usar levaduras genéticamente modificadas por el sector enológico europeo para la reducción del alcohol en vino.
Conclusión
Las técnicas correctivas de reducción del contenido en azúcar de los mostos o del contenido en etanol de los vinos, no tienen que ser las únicas a ser tomadas en cuenta, no son más que una manera de adaptarse, a corto plazo, a una situación que no podría más que perdurar según las previsiones climáticas de las que disponemos. Por lo tanto debemos programar otras inversiones, más bien desde una perspectiva de acercamiento vitícola. Parece sensato, en efecto, examinar las condiciones de adaptación del comportamiento del viñedo a las nuevas condiciones climáticas abriendo así un amplio campo de investigación. La búsqueda, en los institutos de investigación, de variedades no explotadas de material vegetal cualitativo acumulando menos azúcares fermentables durante la maduración de la uva sigue siendo, también, una vía pertinente y técnicamente accesible.
Bibliografía
Dequin, S.; Baptista, E. y Barre, P.: «Acidification of grape musts by Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains genetically engineered to produce lactic acid», Am J Enol Vitic 1999; 50: 45-50.
Henricsson, C.; de Jesus Ferreira, M.C.; Hedfalk, K.; Elbing, K.; Larsson, C.; Bill, R.M.; Norbeck, J.; Hohmann, S. y Gustafsson, L.: «Engineering of a novel Saccharomyces cerevisiae wine strain with a respiratory phenotype at high external glucose concentrations», Appl Environ Microbiol 2005; 71 (10): 6185-6192.
Heux, S.; Cachon, R. y Dequin, S.: «Cofactor engineering in Saccharomyces cerevisiae: Expression of a H2O-forming NADH oxidase and impact on redox metabolism.», Metab Eng 2006; 8 (4): 303-314.
Malherbe, D.F.; du Toit, M.; Cordero Otero, R.R.; Van Rensburg, P. y Pretorius, I.S.: «Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in Saccharomyces cerevisiae and its potential applications in wine production.», Appl Microbiol Biotechnol 2003; 61 (5-6): 502-511.
Remize, F.; Roustan, J.L.; Sablayrolles, J.M.; Barre, P. y Dequin, S.: «Glycerol overproduction by engineered Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains leads to substantial changes in By-product formation and to a stimulation of fermentation rate in stationary phase», Appl Environ Microbiol 1999; 65 (1): 143-149.
