Introducción
A pesar del evidente y reciente progreso en el campo de la enología preventiva, la levadura Brettanomyces bruxellensis sigue siendo la principal causa de contaminación microbiana de los vinos. Algunas veces la contaminación viene de una manera muy perniciosa, especialmente cuando ya se está al final del recorrido del proceso, incluso cuando los niveles de SO2 libre parecen perfectamente adaptados para limitar su crecimiento.
El equipo de investigación del ISVV de Burdeos (Francia), formado por Isabelle Masneuf y Warren Albertin, ha demostrado recientemente que la resistencia de Brettanomyces al sulfuroso depende de su patrimonio genético.
Durante estos estudios se caracterizaron varios cientos de cepas de la levadura contaminante. Los aislamientos obtenidos fueron discriminados por análisis genético de microsatélites (que son zonas repetidas del genoma), lo que permite distinguir grupos de cepas diploides y triploides.
Varios aislados representativos de cada grupo fueron analizados para determinar si eran resistentes o sensibles al sulfuroso. Como resultado se obtuvo que un 40% de las cepas analizadas era resistente a los sulfitos en la habitual concentración de 0,4 mg/L de SO2 molecular. Esto explica por qué existen contaminaciones persistentes de Brettanomyces en vinos a pesar de contener niveles de SO2 libre bastante considerables en relación con las recomendaciones de dosificación habituales. Todas las cepas que son resistentes a los sulfitos tienen la particularidad de tener un patrón genético de tipo triploide para algunas secciones de su secuencia genética. Esto permite utilizar un desarrollo analítico molecular cuya finalidad es detectar y contabilizar este tipo de cepas, el ensayo en cuestión a escala comercial se llama TYP\Brett.
«Con la herramienta TYP/Brett se ha podido identificar, en distintos controles de higiene en bodega, la resistencia al sulfuroso de B. bruxellensis en uvas y vinos.»
El Laboratorio Excell tiene todas las herramientas analíticas disponibles para el análisis de Brettanomyces bruxellensis. El objetivo de esta nueva técnica no es otro que ayudar a las bodegas para que dispongan de una herramienta más útil que la simple identificación y cuantificación de levaduras contaminantes, dependiendo de la situación particular de cada bodega en cuestión. Desde las primeras comunicaciones de Isabelle Masneuf y Warren Albertin, nuestro personal ha estado muy interesado en su trabajo para poder así convertirlo en una aplicación práctica. En los últimos meses, el uso de TYP\Brett no solo ha permitido caracterizar la resistencia al sulfuroso de cepas de Brettanomyces bruxellensis aisladas en uvas y vinos, sino también durante los controles de higiene en bodegas fuera de períodos de vendimia. Esto ya ha dado muchos indicios interesantes:
. La gran mayoría de cepas de Brettanomyces bruxellensis aisladas en el viñedo son cepas sensibles a los sulfitos.
. Las cepas resistentes a los sulfitos son a menudo más feroces metabólicamente en cuanto a la producción de fenoles volátiles.
. El porcentaje de cepas resistentes en mostos y vinos varía según los parámetros físico-químicos y también según las prácticas enológicas (la sulfitación por descontado, pero no es la única…). Esta distribución también varía según los lugares de producción.
. Las cepas aisladas de la propia atmósfera de la bodega, sobre la superficie de depósitos y envases o sobre el pequeño material de vinificación, es donde se encuentran las variedades de cepas triploides, mayormente resistentes al SO2.
Estos datos proporcionan una valiosa información para comprender mejor las vías de colonización de Brettanomyces. Algunas cepas están presentes en las uvas del viñedo, pero son diferentes de las presentes en la bodega, que han desarrollado mecanismos de resistencia a este ambiente hostil, incluyendo resistencia al SO2. Recientemente, microbiólogos que trabajan en el campo de las levaduras presentes en bebidas fermentadas (vinos, cervezas, etc.) dibujaron un árbol filogenético muy interesante.
«Brettanomyces es la especie con más ventajas adaptativas (…), particularmente en su resistencia a los sulfitos en los vinos. Saccharomyces cerevisiae es la que menos ha evolucionado.»
En la parte superior de este árbol encontramos Saccharomyces cerevisiae, que se considera como la levadura más primitiva. En otras palabras, es la que menos ha evolucionado. En la parte inferior de este árbol se encuentra Brettanomyces. Es la prueba de que esta especie es capaz de desarrollar herramientas notables que le permiten tener ventajas adaptativas según las condiciones y en particular su resistencia a los sulfitos en los vinos.
Durante la elaboración de la cosecha de 2018, se supervisó la distribución de cepas sensibles y resistentes en diferentes bodegas. Los resultados se pueden ver en la tabla 1, donde se muestra de hecho, que cuanto más restrictivas sean las condiciones (fermentación alcohólica languideciente, por ejemplo), las cepas más resistentes son las que ganan rápidamente el espacio vacío que la naturaleza aborrece. Hoy en día limitar la presencia de cepas resistentes es un gran reto en el marco de una lucha razonada y preventiva contra la presencia de fenoles volátiles en el vino.
Ya algunas bodegas están aplicando la técnica con el objetivo de lograr un mayor control microbiológico basado en esta distinción entre cepas sensibles y resistentes al SO2. Esto evita el uso innecesario (si las cepas principales presentes son resistentes) o contraproducente (permitiendo que las cepas resistentes utilicen su ventaja adaptativa para convertirse en mayoría) de los sulfitos. Es probable que altas dosis de sulfuroso promuevan el fenómeno de adaptación y resistencia. De hecho, un grupo de individuos llamados súper resistentes ya ha sido aislado de ciertas bodegas cuyo uso de sulfuroso se produce en concentraciones superiores a las habitualmente recomendadas.
Así, pues, en vista de los hallazgos obtenidos se definen varias aplicaciones de la técnica conocida con el nombre de TYP\Brett:
. Como parte de una supervisión regular de los niveles de fenoles volátiles durante un aumento de sus concentraciones, TYP\Brett permite determinar si el uso de SO2 es adecuado o no para limitar la contaminación o si es más efectivo recurrir a otras acciones (quitosano, filtración amicróbica, centrifugación, DMDC, tratamientos de calor, etc.).
. Durante las dos primeras adiciones de SO2 en la ruta de la vinificación y para los ajustes del mismo al final de la fermentación maloláctica, TYP\Brett permite una dosificación más precisa del SO2.
. Como parte de los controles de validación de los procesos de higiene aplicados en las bodegas, TYP\Brett comprueba el buen funcionamiento de los procesos de desinfección después de la limpieza de barricas, el quemado de azufre y el enjuague de pequeños equipos con agua sulfitada.
. Al final del itinerario enológico, TYP\Brett puede evitar la sobredosificación de sulfuroso y el riesgo de ser utilizado innecesariamente, induciendo una modificación del equilibrio redox (reducción de los vinos después del embotellado).
La aplicación analítica es la siguiente:
. Cuantificación de la población total de Brettanomyces en la muestra mediante PCR.
. Un test TYP\Brett aplicado sobre un número de clones representativos según la población inicial contabilizada.
Los resultados provistos por TYP\Brett son la población total de Brettanomyces y el porcentaje de cepas resistente al SO2. La figura 1 ilustra este enfoque a través de un caso concreto.
M: marcador del peso molecular; de 1 a 7: perfiles genéticos de las colonias aisladas del vino; Neg.: control negativo; A: referencia de cepas triploide sensible al SO2; B: referencia de cepas diploide sensible al SO2; C: referencia de cepas triploide resistentes SO2 (habilidad de crecer incluso en vinos con SO2 = 0,4 mg/L)
La metodología TYP\Brett se basa en la contabilización de la población de Brettanomyces bruxellensis, en el cálculo del porcentaje de cepas resistentes, en la medición del SO2 libre y total y en el cálculo del SO2 activo.
La interpretación del caso práctico presentado en la figura 1 es la siguiente: la población total de Brettanomyces es de 5,1 x 103 CFU/mL, siete colonias son analizadas por TYP\Brett, cinco de ellas son cepas triploides resistentes al SO2, y dos son cepas diploides sensibles al SO2.
Conclusiones
Como conclusión, el vino analizado muestra una notable población de Brettanomyces bruxellensis, incluyendo el 70% de las cepas resistentes al SO2. Con el fin de reducir la población y limitar el riesgo de contaminación, es mejor optar por otros tratamientos que el simple reajuste de SO2 libre, lo que no va a ser muy eficaz.
Además de cuantificar el total de la población de Brettanomyces bruxellensis, TYP\Brett hoy en día es el único análisis microbiológico que combina la especificidad de la tipificación genética con información práctica sobre las acciones a llevar a cabo en el control del desarrollo de las células de levadura contaminantes y el deterioro fenolado de los vinos.
Aunque estos estudios y controles de calidad se hayan vuelto más y más rutinarios, resulta imprescindible prestar más atención a la precisión y la sensibilidad de las dosificaciones que se llevan a cabo en los vinos en la determinación de 4-etilfenol y 4-etilguayacol, para asegurarse más si cabe del daño sensorial efectivo. Para ello los análisis acreditados ENAC parecen una buena forma de hacerlo, dado que aseguran la competencia técnica del laboratorio que ofrece aquellos resultados con el sello de garantía ofrecido por normativas internacionales.
