Identificación y cuantificación de Brettanomyces bruxellensis en bodega y en laboratorios especializados

Antes de entrar en materia, queríamos precisar un dato sobre los métodos de identificación y cuantificación de Brettanomyces bruxellensis.

La importancia de la taxonomía y de los conceptos

Como sabréis, la denominación de Brettanomyces bruxellensis corresponde al estado anamorfo (o estado «imperfecto», o de reproducción asexual) de Dekkera bruxellensis, que es su teleomorfo (o estado «perfecto», o de reproducción sexual); la combinación de ambos estados se denomina holomorfo.

La taxonomía de hongos permite estas descripciones con nombres de género distintos en estas ocasiones, y mantener así las denominaciones de Brettanomyces y Dekkera para dos estados del mismo organismo. Pues bien, la gran mayoría de métodos de identificación y cuantificación de esta especie no distinguen entre estados anamorfo y teleomorfo, por lo que aunque se habla generalmente de «Brettanomyces», en realidad estamos queriendo decir «Brettanomyces/Dekkera» en este tipo de ensayos. En otras palabras, estaremos detectando, identificando y cuantificando cualquiera de los dos estados de este holomorfo, sin distinguir entre ellos. En algunas ocasiones, esto no acarrea ningún problema y no tiene ninguna transcendencia. En otros, sin embargo, puede proporcionar una información incompleta que pudiera tener interés tecnológico, como por ejemplo el mencionado caso por Palacios en este mismo dossier donde indica que Dekkera es bastante más resistente al sulfuroso que Brettanomyces,¹ probablemente debido a su mayor carga génica y/o su capacidad de esporular. Para diferenciar entre Brettanomyces y Dekkera cuando realmente interese, podríamos recurrir a otros tipos de análisis genético.

Es conveniente hacer otra precisión importante cuando vamos a hablar de los términos identificación, detección, tipificación, o cuantificación:

• Identificación hace relación a cuando describimos a un organismo poniéndole nombre de género y especie.

• Detección es cuando somos capaces de encontrarlo en un determinado hábitat, independientemente de su estado o número. Lógicamente, una detección implica una identificación: no podemos detectar Brettanomyces si no podemos afirmar que es Brettanomyces.

• Tipificación hace referencia a la distinción entre cepas de una misma especie.

• Cuantificación es determinar el número o concentración de un organismo dado.

Conviene también recordar que cada método de identificación, detección, tipificación, o cuantificación tiene sus características y propiedades, así como sus límites.

Y ¿qué ocurre con la «viabilidad» de un microorganismo?

Muchas veces tendemos a pensar que el determinar por ejemplo la «viabilidad» de un microorganismo debe ser independiente del método, y nada más lejos de la realidad. Si lo hacemos mediante el método clásico de siembra en placa y cuantificación del número de colonias que aparecen en las mismas, tendremos un determinado sesgo según el método y solución en la que realicemos las diluciones, y, mucho más importante, el medio y condiciones de cultivo donde se siembran las células.

Por más, estaremos observando la cultivabilidad, es decir, la capacidad de las células de cultivarse en medios de laboratorio, y por lo tanto de crecer en ellos dando colonias aisladas.

Pero podemos determinar la «viabilidad» por ejemplo tras tinción con azul de metileno y observación al microscopio, donde lo que marcará la diferencia entre «vivas» y «muertas» vendrá determinada por la capacidad de cada célula de reducir dicho colorante; nada que ver con su capacidad de crecer formando colonias sobre las placas. Algo semejante va a ocurrir con otros colorantes como la rodamina, por ejemplo. Podemos utilizar también mediciones de la impedancia del medio, medida también indirecta de la «viabilidad», o la capacidad de las células para ser teñidas o no con colorantes como el ioduro de propidio, u otros.

Y muchos otros métodos alternativos, como hemos dicho cada uno con sus propiedades, ventajas e inconvenientes, pero que miden propiedades distintas, y por lo tanto nos darán una información diferente. Es importante conocer esta distinción, ya que frecuentemente no se tiene en cuenta esta realidad y se confunden los conceptos. En otras ocasiones, es usual que se pretenda que dos métodos distintos arrojen el mismo resultado (por ejemplo, cultivo en placa y tinción con azul de metileno o PCR cuantitativa), cuando en realidad miden propiedades distintas.

En otro orden, cada vez más habitualmente se habla de las células viables no cultivables, también para Brettanomyces,^2,3 y se hace referencia en este caso a células que mantienen su capacidad metabólica pero que dan negativo en pruebas de viabilidad y no pueden ser recuperadas en placas de cultivo. El peligro que pueden aportar estas células, en este caso es debido a que pueden mantener aún su capacidad de alterar el vino a pesar de no ser detectables ni cuantificables como células «vivas».

Aclarados todos estos aspectos, pasamos ya a tratar propiamente el tema de la identificación y cuantificación de Brettanomyces bruxellensis en bodega y en laboratorios especializados.

Métodos de detección de B. bruxellensis

Métodos de cultivo

Probablemente ya todos conoceréis que existen una serie de medios de cultivo más o menos especializados para la detección y cuantificación de Brettanomyces, normalmente medios sólidos,^3-15 pero también líquidos.^13,16-18 En algunas ocasiones este crecimiento líquido se combina con el análisis de etilfenoles producidos en estos medios como sistema de detección/comprobación, y a veces se incrementa la sensibilidad facilitando la detección enzimática del 4-etilfenol.¹⁹ Algunos de ellos son selectivos para Brettanomyces (teóricamente solo crece esta especie), y otros diferenciales (pueden crecer otros organismos, si bien se pueden diferenciar por alguna característica como el color de la colonia), pero realmente ninguno de ellos es realmente perfecto y permite que crezcan todas las células vivas (o cultivables) de Brettanomyces bruxellensis, y solamente las de esa especie. Por ello, es fácil que se produzcan si no errores (falsos negativos o falsos positivos), al menos sesgos importantes.

«Cada método de identificación, detección tipificación o cuantificación tiene sus características, propiedades y límites.»

En alguno de los métodos de cultivo se emplea además un enriquecimiento, muy útil para recuperar células dañadas o debilitadas cuando venimos de condiciones restrictivas como es el vino (presencia de inhibidores como SO₂, etanol, fenoles, etc.), y que permite la recuperación de las células y por lo tanto su cultivo o detección molecular. El problema es que si enriquecemos el cultivo en una especie, alteramos las cantidades y proporciones de los organismos inicialmente presentes en la muestra. En otras palabras, si un método emplea un enriquecimiento, no nos sirve para cuantificar la población inicial, aunque sí para detectar.

Otra particularidad de los métodos culturales es el requisito de un tiempo elevado para obtener resultados (típicamente de 1 a 2 semanas), por lo que las demoras en la toma de decisiones suponen un inconveniente importante cuando hablamos de procesos industriales. Es cierto por otro lado que estos métodos requieren poco equipamiento y no son difíciles de adaptar a las condiciones de los laboratorios de la mayoría de bodegas (existen diferentes empresas que comercializan los medios ya preparados listos para su uso), pero en muchos casos los enólogos prefieren recurrir para mayor seguridad a microbiólogos expertos que realizan los análisis en laboratorios especializados.

Métodos moleculares

En cuanto a los métodos moleculares, tienen la ventaja de que son mucho más rápidos que los culturales, permitiendo obtener resultados en unas pocas horas la mayoría de ellos. En muchas ocasiones, se basan de una u otra forma en la técnica de PCR, por lo que se obtiene una respuesta rápida, muy específica, y que en ocasiones permite la cuantificación.^{2-4,9,11-14,18,20-35}

Una ventaja de esta técnica de PCR cuantitativa (o qPCR) es que puede realizarse en ocasiones incluso con células enteras, sin necesidad de ningún tipo de extracción.35 Ello proporciona una ventaja económica, pero también el presentar un menor sesgo al no depender de una extracción y cuantificación del DNA, paso que siempre puede introducir un error adicional en el método.

La cuantificación de Brettanomyces por métodos moleculares, como la de cualquier organismo del vino, presenta una dificultad importante si pretendemos hacerla de forma correcta, dada la presencia como hemos dicho anteriormente de inhibidores naturalmente presentes como SO₂, etanol, fenoles, etc. Pero hay otros muchos compuestos que se añaden habitualmente al vino como bentonita, quitosano, celulosa, alginato, chips, poliaspartato, DMDC, nutrientes, cultivos iniciadores, carbonato cálcico, ácidos orgánicos, etc., los cuales además en muchas ocasiones contienen una gran cantidad de impurezas, en la mayoría de los casos de tipo y concentración desconocida. Eso se traduce, por un lado, en que la diversidad y cantidad de sustancias inhibidoras en los vinos sea muy elevada, y por otro, su presencia introduce un factor adicional de diversidad en la composición química de los vinos según se añadan unos u otros compuestos, y en una cantidad u otra.

De hecho, podríamos casi considerar que cada vino es diferente en este sentido: aparte de su distinta composición inicial, los tratamientos que va a sufrir cada vino concreto pueden ser muy diversos. Por tanto, si las matrices de partida para el análisis microbiológico son diferentes para los distintos vinos, va a ser muy difícil la estandarización, siendo necesario contemplar cada caso por separado y estudiar cada vino independientemente y con suficiente cuidado. La presencia de esos inhibidores mencionados antes hace que las técnicas de PCR, como de las otras metodologías moleculares, resulten inhibidas muchas veces de forma parcial, lo cual redunda negativamente en la especificidad y eficacia de las mismas.

Cómo interpretar los resultados

De ahí que es realmente muy complicado obtener resultados cuantitativos realmente representativos de cuál es la cantidad exacta de microorganismos que se halla presente en la muestra original, incluso si realizamos «limpieza» de las muestras para eliminar o reducir la cantidad de inhibidores (con PVP o PVPP, BSA, etc.), empleamos patrones internos, realizamos numerosas diluciones y réplicas, etc. No queremos indicar que no sea posible realizar una cuantificación de B. bruxellensis presente en un vino mediante métodos moleculares, al igual que cualquier otro microorganismo, sino que realmente hay que realizarlo de una forma muy cuidadosa y con todos los controles y garantías pertinentes. De este modo, es muy posible que las eficiencias de la técnica varíen según las características del vino, así como los límites de detección y cuantificación de B. bruxellensis.

«Como cada vino presenta unas características diferentes, no nos sirve tener «una recta de calibrado» para cuantificar, sino que hemos de rehacerla y comprobarla prácticamente en cada caso.»

En vinos más «fáciles» (menores cantidades de inhibidores como sulfuroso, etanol, polifenoles, etc.), podemos tener unas respuestas cuantitativas de muy amplio rango, límites de sensibilidad más bajos, mayor consistencia y repetitividad, etc., mientras que en vinos «difíciles» la situación será totalmente la contraria, pudiendo ser muy complicado obtener resultados fiables y realmente cuantitativos. Además en estos vinos con más inhibidores se dará más fácilmente un resultado falso negativo, como consecuencia lógica de la dificultad de los mismos para permitir la amplificación de DNA. Como cada vino presenta pues unas características diferentes, no nos sirve tener «una recta de calibrado» para cuantificar, sino que hemos de rehacerla y comprobarla prácticamente en cada caso.

Técnicas de PCR

En algunas ocasiones, la técnica de PCR se utiliza conjuntamente con otras que le proporcionan más especificidad, sensibilidad, o capacidad discriminante, como las técnicas de DGGE, RFLP, ITS, AFLP, etc.,^13,21,30,36 de manera que puede servir por ejemplo para tipificar cepas dentro de la especie B. bruxellensis.^37,38 De esta forma, se puede conocer si la misma cepa es la que se halla presente en vinos distintos o no dentro de la misma bodega, o ver diferentes sensibilidades de distintas cepas a un mismo tratamiento antimicrobiano.

PCR cuantitativa. Otra ventaja de las técnicas de PCR, especialmente la PCR cuantitativa, es que se puede emplear conjuntamente con compuestos como el PMA (monoazida de propidio) que permiten solamente la amplificación de las células vivas.15,20 Si se realiza un experimento por duplicado con PMA y sin PMA (PMA-qPCR), se puede determinar el número respectivamente de células vivas y células totales, calculando por diferencia las células muertas. Mediante esta técnica también se pueden detectar las células viables no cultivables.³⁹

Las posibilidades que abre este tipo de aproximación son muchas para controlar Brettanomyces y otros muchos microorganismos de interés enológico. Podemos por ejemplo conocer la efectividad de un tratamiento antimicrobiano como una filtración, sulfitado, adición de quitosano, DMDC, etc. Puede usarse para ver la efectividad de una limpieza e higienización de barricas, línea de embotellado, etc. Podemos ver si a lo largo de un proceso de crianza las poblaciones de B. bruxellensis, tanto vivas como muertas, aumentan, disminuyen, o permanecen estables, cómo les afecta la microoxigenación o un trasiego, qué ocurre tras mezclar vinos con distintas características y cantidades de microorganismos, comprobar si el efecto de la adición de un nutriente puede ser contraproducente al incentivar el crecimiento de estas levaduras alterantes, entre otras situaciones.

Con todo, esta técnica de determinación de la «viabilidad» con PMA (u otros compuestos semejantes) presenta un determinado sesgo, como todas. En este caso depende de la capacidad de las células «muertas» de permitir la entrada de un compuesto fotosensible, como el PMA, mientras que las «vivas» presentan una membrana menos permeable que no permite la penetración de esos colorantes. Cuando el PMA se encuentra dentro de la célula y es tratado con luz, se une al DNA y no permite que éste sea amplificado; de este modo, solo será amplificable el DNA que esté dentro de las células «vivas», ya que no ha penetrado en ellas el colorante. Como vemos, es una reacción que depende en realidad de la permeabilidad de la membrana de una célula, no exactamente su «viabilidad».

Si tenemos en cuenta que el vino es un líquido hidroalcohólico con pH bajo, podemos entender que la membrana de una célula que viva en vino no puede tener la misma funcionalidad, composición ni integridad que si estuviera en un medio de cultivo, sin inhibidores, y a su pH óptimo. En otras palabras, muy probablemente la integridad de la membrana de una célula viva en el vino ya va a ser de partida menor que en medio de laboratorio, y va a ser más difícil de distinguir con estos métodos una célula «viva» de una célula «muerta».

Recordemos además que cada vino es distinto. Va a ser necesario pues hilar muy fino si pretendemos trabajar de forma cuantitativa con estos métodos, y ser siempre muy conscientes de cuál es el parámetro que estamos evaluando: penetrabilidad de un colorante a través de la membrana en este caso.

qPCR con mRNA. Otra forma de evaluar la viabilidad con qPCR es usando mRNA como molécula diana para su cuantificación,^3,39 dado que se estima que el mRNA es una molécula que tiene una vida muy corta y solamente detectará las células «vivas».

Volvemos a la consideración de qué es lo que estamos realmente midiendo para determinar que una célula esta «viva»; en este caso, es que posea una determinada cantidad de un mRNA concreto que sirve como diana. Es una técnica mucho menos empleada que otras con la misma finalidad.

LAMP. Una técnica molecular muy interesante es la de loop-mediated isothermal amplification (LAMP), que permite una amplificación isotérmica del DNA. No requiere de un equipamiento costoso (solamente un baño o incubador a temperatura constante), y permite la detección, identificación o incluso cuantificación de un microorganismo concreto.

«La LAMP es un método que amplifica el DNA de forma específica, mucho más rápidamente incluso que la PCR.»

Para algunas aplicaciones, se ha logrado adaptar incluso a un sistema convencional como las tiras reactivas (como las empleadas en pruebas de embarazo o algunas reacciones inmunológicas), de fácil uso e interpretación. En el caso de Brettanomyces existen ya diferentes trabajos empleando esa técnica de LAMP,^3,13,40-42 la cual también puede acoplarse al uso de PMA para diferenciar viables, o utilizar incluso células enteras sin necesidad de extraer DNA.⁴²

Otras técnicas. Otras muchas técnicas han sido descritas para la detección/ identificación/ cuantificación de Brettanomyces/Dekkera, como por ejemplo la hibridación Dot-blot,²² hibridación sobre filtro para muestras de aire,⁴³ electroforesis en campo pulsante (PFGE),³⁰ métodos de inmunología mediante ELISA,¹⁴ inmunosensor electroquímico amperométrico,⁴⁴ hibridación in situ sobre filtro (FISH),^13,45-50 citometría de flujo (CF),^{2,13,47,49,51-53} citometría de imágenes microscópicas,54 secuenciación masiva (NGS),^55,56 chip electrónico de hibridación (Enochip),⁵⁷ o biosensores de resonancia de plasmón de superficie localizado.⁵⁸

¿Son necesarias tantas técnicas?

Las preguntas que surgen de forma inmediata son evidentes: ¿para qué tantas técnicas? ¿Son todas necesarias? ¿Cuál es la mejor? ¿Alguna de ellas puedo usarla en mi bodega? Evidentemente cada una de las técnicas tendrá ventajas e inconvenientes, y como en otros muchos aspectos no hay una que sea perfecta. No es algo ilógico que nos planteemos estas preguntas, al contrario, y lo mismo va a ocurrir con cualquier otro parámetro enológico que queramos determinar.

Por ejemplo, ¿cuántas formas hay de estimar el grado alcohólico de un vino, de la acidez volátil, el sulfuroso o el ácido málico? Muchas, cada una con sus propiedades, ventajas e inconvenientes. Y de entre estos métodos (unos más rápidos, otros más baratos, otros más exactos…), alguno(s) son considerados métodos oficiales, y usados de referencia. Pero esta situación que está muy clara y reglamentada para parámetros físico-químicos, no lo está para los microbiológicos, y la microbiología es también en esto la hermana pobre dentro de la enología.

Por tanto, volviendo a la pregunta: ¿qué técnica podemos emplear para detectar/cuantificar Brettanomyces/Dekkera?

Además de los medios selectivos/diferenciales comentados arriba, la PCR cuantitativa es quizá una de las más empleadas, y cada vez son más los laboratorios que empiezan a conjuntarla con el uso de PMA para la diferenciación de células vivas y muertas (y de viables no cultivables). Cada vez existe más experiencia con ellas y se va trabajando de una forma más controlada. Con todo, no debemos olvidarnos que «la» qPCR para Brettanomyces (y para todos los organismos en realidad) no lo es tal sino «las» qPCR, dado que existen numerosas variantes, empleando por ejemplo distintos tipos de sondas: simples, TaqMan, Scorpions, Molecular Beacons, etc. (aparte de nombres divertidos, esta variedad introduce un elemento adicional de falta de homogeneidad de los métodos, tal como comentábamos antes). Pero unas y otras funcionan, volvemos a decir que con sus pros y sus contras, por lo que son una buena elección cualquiera de ellas.

Citometría de flujo

Otra técnica que va adquiriendo cada vez más difusión, aunque muy lentamente como todas las técnicas microbiológicas que se adoptan en enología, es la citometría de flujo (CF). Una de las ventajas de esta técnica es que nos permite la detección directa de cada una de las células de una población de decenas de miles de ellas y en poco tiempo, así como conocer otras características de estos organismos al mismo tiempo. Puede dar pues un valor añadido importante a la información que obtenemos en un solo experimento, y constituye una alternativa cada vez más interesante a la qPCR, permitiendo también detectar, identificar, o cuantificar.

Conclusiones

Sin embargo, en nuestro caso y si tuviéramos que decantarnos hoy por hoy por una sola de las técnicas de detección/cuantificación de Brettanomyces/Dekkera, posiblemente lo haríamos por la técnica de LAMP. En un método que amplifica DNA de forma específica, mucho más rápidamente incluso que la PCR, no necesita equipamiento complejo puesto que se realiza en condiciones isotermas (un incubador, baño o bloque térmico sencillo es suficiente), puede hacerse de forma cuantitativa, se puede efectuar con células enteras o mínimamente procesadas, se puede aplicar a mostos y vinos tanto blancos como tintos, es de fácil visualización e interpretación, y puede detectarse directamente por turbidez (cuantificable o detectable incluso a ojo), puede facilitarse su lectura mediante el uso de colorantes convencionales o fluorescentes, adaptarse a sistemas de detección tan fáciles y conocidos como tiras reactivas, detectarse por electroforesis, o emplearse con equipos de qPCR convencionales.

Por lo tanto, es una técnica con una gran versatilidad (su adopción en bodegas puede ser muy fácil, pero también en laboratorios más especializados y sofisticados), necesita poca inversión y mantenimiento, y que esperemos que en un futuro cercano pueda comercializarse de forma amplia, no solamente para Brettanomyces bruxellensis, sino para una gama mucho más amplia de microorganismos enológicos.

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